УДК 616.36:616-092.9

Н.И. БЕЛОСТОЦКИЙ, Г.Г. ВАРВАНИНА, Е.В. ТКАЧЕНКО, С.Г. ХОМЕРИКИ

Московский клинический научно-практический центр Департамента здравоохранения города Москвы, г. Москва

динамика развития фиброза печени и изменений маркёров фиброгенеза у крыс под воздействием четырёххлористого углерода

Цель — исследование динамики формирования фиброза печени под воздействием хронического токсического повреждения печени CCl₄ с параллельным исследованием морфологических изменений в печени и динамики изменений маркёров фиброгенеза в сыворотке крови у подопытных животных. Материал и методы. Был исследован материал: ткань печени и сыворотка крови от 20 животных в 4 группах: контрольная, через 14, 30 и 90 суток от начала введения CCl₄. Исследовались морфологические признаки патологических изменений в ткани печени, уровни TNFα, TGFβ, IL-10, коллагена-IV, гиалуроновой кислоты в сыворотке крови. Результаты. Токсическое воздействие CCl₄ приводит к фибротическим изменениям в ткани печени с нарастанием степени фиброзирования к 90-м суткам. Следует отметить умеренность нарастания процессов фиброзирования, что может быть связано с параллельно протекающим процессом регенерации паренхиматозных клеток. В крови наблюдалось нарастание уровня провоспалительного цитокина TNFα и снижение уровня противовоспалительного цитокина IL-10, умеренно выраженное возрастание уровня TGFβ. Исследование прямых маркёров фиброгенеза — коллагена-IV и гиалуроновой кислоты показало раннее увеличение и постоянство этого увеличения для коллагена-IV и вместе с тем тенденцию к снижению уровня гиалуроновой кислоты на 30-90-е сутки исследования, что может говорить об активации процессов разрушения гиалуроновой кислоты на определённых этапах фиброзообразования, связанных как с ферментными, так и неферментными процессами разрушения гиалуронана.

Ключевые слова: печень, токсическое повреждение, фиброз, CCl₄, маркёры фиброгенеза.

Контактное лицо:

Белостоцкий Николай Игоревич

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Московского клинического научно-практического центра

111121, г. Москва, ш. Энтузиастов, д. 86, тел. (499) 304-30-96, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Contact:

Belostotsky Nikolay I.

D. Med. Sc., Senior Researcher of Moscow Clinical Scientific and Practical Center

86 shosse Entuziastov, Moscow, Russian Federation, 111121, tel. (499) 304-30-96, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

N.I. BELOSTOTSKY, G.G. VARVANINA, E.V. TKACHENKO, S.G. HOMERIKI

Moscow Clinical Scientific and Practical Center, Moscow

Dynamics of development of liver fibrosis and changes of markers of fibrogenesis in rats under influence of carbon tetrachloride

Study objective — to investigate the developmental stages of liver fibrosis resulting from chronic carbon tetrachloride (CCl₄)-induced toxic liver injury and to access the accompanying changes in hepatic morphology and serum markers of fibrogenesis over time in experimental animals. Materials and methods. We assessed liver tissue samples and serum samples in 20 animals, which were divided into 4 groups: the control group and three groups where the assessments were performed 14, 30 and 90 days after the first day of CCl₄ exposure, respectively. We investigated the morphological signs of abnormal changes in liver tissue and measured serum of TNFα, TGFβ, IL-10, collagen IV and hyaluronic acid. Results. The toxic effects of CCl₄ induced fibrotic changes in liver tissue, which had exacerbated by 90^th day. These changes progressed at a moderate rate, which may be related to concomitant regeneration of parenchymatous cells. Blood tests showed at increase in TNFα, a proinflammatory cytokine, and a decrease of IL-10, an anti-inflammatory cytokine, coupled with a moderate increase in TGFβ. As for direct markers of fibrogenesis, the study showed an early, increase in collagen IV levels and a trend towards a decrease in hyaluronic acid levels between 30^th and 90^th days. This can be indicative of more active destruction of hyaluronic acid in certain stages of fibrogenesis, when hyaluronate is destroyed through both enzymatic and non-enzymatic mechanisms.

Key words: liver, toxic injury, fibrosis, CCl₄, markers of fibrogenesis.

Фиброгенез — универсальный процесс прогрессирования хронических заболеваний печени, не зависящий от этиологических факторов, связанный с заменой паренхиматозных клеток соединительной тканью [16]. Фиброз является конечным результатом хронических воспалительных процессов, вызванных различными патологическими стимулами: хроническая инфекция, аутоиммунные реакции, лекарственные, химические и иные повреждения ткани печени [17]. Увеличение образования соединительной ткани происходит в результате активации звёздчатых клеток, которая стимулируется при гибели паренхиматозных клеток. Активация звёздчатых клеток является основным событием фиброгенеза и определяет ответ печени на повреждение. Основным медиатором фиброгенеза является трансформирующий фактор роста бета (TGFβ) [4, 5].

В исследованиях механизма патогенеза острых и хронических повреждений печени используются экспериментальные модели. Одна из часто применяемых моделей — острое или хроническое поражение печени при интоксикации тетрахлорметаном (CCl₄). Длительное введение CCl₄ приводит к развитию дистрофических некротических изменений в печени, что позволяет наблюдать картину развивающегося фиброза и цирроза печени в динамике. Отработанность этой экспериментальной модели и аналогии с морфологической картиной цирроза печени у человека привели к широкому использованию CCl₄ для индукции хронического повреждения печени, особенно при моделировании первичного цирроза печени [13]. Механизм повреждающего действия CCl₄ основан на образовании в эндоплазматическом ретикулуме активных промежуточных продуктов, образующихся при его расщеплении цитохромом Р450 [1]. CCl₄ в основном вызывает центролобулярные повреждения, переходящие в фиброз и центролобулярный цирроз [15]. Важным является изучение механизмов формирования фиброза печени с измерением уровня маркёров фиброгенеза в крови на различных стадиях фиброгенеза [7, 19].

Цель работы состоит в исследовании динамики формирования фиброза печени под воздействием хронического токсического повреждения печени CCl₄с параллельным исследованием морфологических изменений в печени и динамики изменений маркёров фиброгенеза в сыворотке крови у подопытных животных.

Материал и методы

Исследования проводились на белых крысах-самцах породы Wistar массой 250-350 г. Крысы содержались на стандартном рационе и получали корм и воду adlibitum. Оценка состояния животных проводилась путем ежедневного осмотра и определения основных параметров жизнедеятельности. Исследовались признаки общего угнетения, подвижность, состояние шерсти, состояние видимых слизистых оболочек, поведение, двигательная активность. Проводилась пальпация, оценивалась пастозность крупа и загривка. Два раза в неделю проводилось взвешивание животных, оценивалось потребление пищи и воды.

Исследования проведены на четырех группах животных по пять животных в группе. Токсическое поражение печени моделировали путём подкожного введения CCl₄ (50%-ный раствор в оливковом масле в дозе 0,1 мл/100 г массы тела) 3 раза в неделю. Забой животных проводился на сроках 14, 30 и 90 суток от начала введения CCl₄. При забое проводилось взятие крови.

Гистологическое исследование. Ткань печени фиксировалась во 10%-ном растворе формалина, проводилось обезвоживание и заключение образцов в парафин. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином (по Ван-Гизону). Оценка степени фиброзирования ткани проводилась по системе METAVIR.

В сыворотке крови измеряли уровень TNFα, TGFβ, IL-10, коллагена-IV, гиалуроновой кислоты иммуноферментным методом.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 8. Достоверность различий оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

При исследовании состояния животных было найдено, что на сроках 14 и 30 суток существенного изменения состояния животных в опытных группах по сравнению с интактными животными не произошло. По мере увеличения продолжительности введения CCl₄ на сроке 90 суток от начала введения препарата у животных наблюдались признаки общего угнетения, слабое удержание шерсти и подшёрстка, замена видоспецифического запаха на запах «палых яблок», легкая иктеричность видимых слизистых оболочек, иктеричность носогубного треугольника, мочки носа, видимой части третьего века. При изучении поведенческих особенностей наблюдалось отсутствие интереса в пище, снижение аппетита. При пальпации животных отмечалась пастозность крупа, загривка, повышение тургора ткани. Наблюдалась выраженная полидипсия на свежую воду. Потребление у опытных животных возрастало до 60 мл на одно животное в сутки (в норме — 35 мл). Отмечалось увеличение относительной массы печени к массе тела животных на 90-е сутки на 30% по сравнению с контрольными животными. Во время вскрытия животных на 90-е сутки наблюдалась выраженная кровоточивость подкожной жировой клетчатки и кожи.

При гистологическом исследовании найдено, что введение CCl₄ привело к морфологическим изменениям печени: на 14-е сутки наблюдалась выраженная жировая дистрофия гепатоцитов, очаговый некроз гепатоцитов, явления начального фиброза центральных вен, портальных трактов, расширение портальных вен, расширение синусоидов, отек портальных трактов, в гепатоцитах наблюдалась белковая дистрофия. На 30-е сутки отмечены некрозы гепатоцитов, наличие воспалительного инфильтрата вокруг портальных трактов, отечность портальных трактов, фиброз портальных трактов с формированием портопортальных септ, выраженная крупнокапельная жировая инфильтрация перипортальных гепатоцитов. Наблюдались проявления пролиферации гепатоцитов: анизокариоз, увеличение числа митозов, наличие двуядерных гепатоцитов. Наблюдались участки внутриклеточного холестаза в перипортальных гепатоцитах, гиперплазия клеток ретикулоэндотелиальной системы. На 90-е сутки исследования в ткани печени наблюдалась крупнокапельная жировая инфильтрация гепатоцитов, расширение синусоидов, участки ацидофильной дистрофии, наличие крупноядерных клеток, что является свидетельством активации регенераторного процесса по замещению некротизированной паренхимы печени, то есть, введение CCl₄ вызывает как повреждение печени, так и стимуляцию регенераторных процессов [12]. Количество соединительной ткани вокруг портальных трактов увеличилось. Наблюдалось наличие портопортальных и портоцентральных септ, начало формирования ложных долек — ранних стадий цирроза печени.

При исследовании уровня TNFα в различные сроки от начала введения CCl₄ наблюдалось возрастание его уровня на протяжении всего времени исследования до 209% (p<0,05), 434% (p<0,05) и 340% (p<0,05) для 14, 30 и 90 суток соответственно (табл. 1). Увеличение уровня TNFα в сыворотке крови на всех сроках наблюдения свидетельствует о ранней активации синтеза этого противовоспалительного цитокина и поддержании повышенного уровня продолжительное время, что способствует углублению и утяжелению патологического процесса. Синтез и секреция провоспалительных цитокинов — необходимый процесс для инициации и прогрессирования фиброза печени [21]. Про- и противовоспалительные цитокины вовлечены в развитие повреждений печени [8]. TNFα главным образом продуцируется макрофагами, моноцитами и Т-клетками в ответ на повреждение печени различными повреждающими агентами. Кроме того, TNFα синтезируется также гепатоцитами и звёздчатыми клетками [8, 3] при заболеваниях печени и токсических поражениях, в частности в ответ на CCl₄. Апоптоз является доминирующим процессом при повреждении печени в ответ на возрастание уровня TNFα [3].

Исследование уровня TGFβ показало рост его уровня до 131% (p<0,05), 138% (p<0,05) и 127% (p<0,05) на сроках 14, 30 и 90 суток соответственно (табл. 1). TGFβ является основным стимулирующим фактором для звездчатых клеток, возрастает в сыворотке крови при патологии печени и коррелирует с тяжестью заболевания [10]. Умеренное, но статистически значимое возрастание уровня TGFβ в настоящем исследовании может свидетельствовать об умеренной тяжести фибротического процесса, что соответствует данным проведенного морфологического исследования.

При исследовании уровня IL-10 было найдено его снижение до 43, 37 и 47% на 14, 30 и 90-е сутки соответственно. Статистически значимо было снижение на 30-е сутки (p<0,05). Тем не менее, отчетливая тенденция к снижению IL-10 имела устойчивый характер и наблюдалась с 30-х по 90-е сутки наблюдения. Снижение уровня IL-10 в наших исследованиях говорит о снижении иммунорегулирующей функции цитокина и способствует более интенсивному повреждению печени и стимуляции фиброгенеза в условиях воздействия CCl₄ [17]. Так как у IL-10 найдены антифиброгенные свойства [14], его длительное снижение может способствовать прогрессированию фиброза печени. Следует учитывать, что IL-10 ингибирует функции звездчатых клеток [20], стимулируя их апоптоз [21]. Подавление функции звездчатых клеток под воздействием IL-10 приводит к опосредованному влиянию на фиброгенный ответ звездчатых клеток за счет снижения секреции TGFβ [21]. Таким образом, IL-10 оказывает многостороннее сдерживающее влияние на фиброгенез и тенденция к его длительному снижению, наряду с повышением уровня TNFα и TGFβ оказывают профиброгенное воздействие и способствуют развитию фиброза печени при хроническом воздействии CCl₄ в условиях проведенного эксперимента.

Комплексное исследование провоспалительного (TNFα) и противовоспалительного (IL-10) цитокинов, а также TGFβ свидетельствует об отклике этих маркеров и изменении их соотношения в сыворотке крови на ранних стадиях развития фиброза печени.

При исследовании прямых маркеров фиброгенеза: коллагена-IV и гиалуроновой кислоты найдено, что уровень коллагена-IV возрос в сыворотке крови подопытных животных до 301% (p<0,05), 482% (p<0,05) и 502% на 14-е, 30-е и 90-е сутки соответственно (табл. 1). Возрастание уровня коллагена-IV является важным проявлением патологического процесса в печени с учетом того, что коллаген-IV — важный структурный элемент базальных мембран и его возрастание в крови свидетельствует о его замене в базальной мембране на фибриллярные коллагены [9]. Исследование уровня гиалуроновой кислоты показало снижение до 61% (p>0,05) и 71% (p>0,05) на 30-е и 90-е сутки. Исследование уровня гиалуроновой кислоты, синтезируемой звездчатыми клетками, считается одним из чувствительных показателей активности фибротического процесса [6], однако высокий уровень гиалуронана в крови может быть отражением повышенного синтеза его в других тканях и не связан с патологией печени [2]. Следует отметить, что гиалуроновая кислота является лабильным веществом, наиболее лабильным элементом внеклеточного матрикса, и может подвергаться интенсивному разрушению ферментативным (гиалуронидазы) и неферментативным путями. Обмен гиалуроновой кислоты происходит значительно быстрее, чем обмен коллагенов [11]. Молекулы гаилуроновой кислоты разрушаются внеклеточно. Неферментативное разрушение происходит под воздействием активных радикалов кислорода [18]. Разрушение такого рода, как правило, присутствует в местах воспаления и повреждения тканей. Отсутствие увеличения уровня гиалуроновой кислоты и тенденция к снижению ее уровня вероятно свидетельствует об активации как ферментативного разрушения гиалуроновой кислоты гиалуронидазами, так и неферментативного разрушения активными радикалами кислорода и хлора на начальных стадиях формирования фиброза печени под воздействием CCl₄.

Выводы

1. Начальные признаки фиброза в печени возникают через 14 дней от начала введения CCl₄ и выражаются в фиброзировании центральных вен и портальных трактов (F1).

2. Начало формирования септ наблюдается на 30-е сутки от введения CCl₄ (F2).

3. На 90-е сутки исследования наблюдается формирование портопортальных септ, портоцентральных септ, начало формирования ложных долек — начальных стадий фиброза печени (F3).

4. При исследовании уровня цитокинов найдено значительное уровня TNFα, умеренно выраженное увеличение TGFβ, снижение уровня IL-10 на протяжении всего времени исследования.

5. В крови увеличен уровень коллагена-IV на протяжении всего времени исследования и имеется тенденция к снижению уровня гиалуроновой кислоты на 30-е-90-е сутки от начала введения CCl₄.

Таблица 1

Динамика изменений маркёров фиброгенеза на различных сроках формирования фиброза печени (М±σ)

Примечание: * — p<0,05 (критерий Манна — Уитни)    

Литература

1.       Brattin W.J. Pathological mechanisms in carbon tetrachloride hepatotoxity / W.J. Brattin, E.A. Glende, R.O. Recknagel // J. Free Radic. Biol. Med. — 1985. — Vol. 1. — P. 27-38.

2.       Emlen W. Measurement of serum hyaluronic acid in patients with rheumatoid arthritis: correlation with disease activity / W. Emlen, J. Niebur, G. Flanders et al. // J. Rheumatol. — 1996. — Vol. 23. — P. 974-978.

3.       Feldstein A.E. Hepatocyte apoptosis and fast expression a prominent features in human non-alcoholic steatohepatitis / A.E. Feldstein, A. Canbay, P. Angelo // Gastroenterol. — 2003. — Vol. 125. — P. 437-443.

4.       Freedman S.L. Mechanism of disease: mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications / S.L. Freedman // Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. — 2004. — Vol. 1. — P. 98-105.

5.       Freedman S.L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury / S.L. Freedman // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 2247-2250.

6.       George J. Serum hyaluronan and hyaluronidase: very early markers of toxic liver injury / J. George, I.R. Stern // Clin. Chim. Acta. — 2004. — Vol. 348. — P. 189-197.

7.       Gressner A.M. Non-invasive biomarkers for monitoring the fibrogenic process in liver: a shot survey / A.M. Gressner, C.F. Gao, O.A. Gressner // World J. Gastroenterol. — 2009. — Vol. 15. — P. 2433-2440.

8.       Malhi H. Hepatocyte death: a clear and present danger / H. Malhi, M.E. Gucciardi, G. J. Gores // Physiol. Ref. — 2010. — Vol. 90. — P. 1165-1194.

9.       Maruyama K. Formation and degradation of basement membrane collagen / K. Maruyama, I. Okazaki, T. Takagi et al. // Alcohol Alcohol Suppl. — 1991. — P. 369-374.

10.    Moreno M. Cytokines and rennin-angiotensin signaling in hepatic fibrosis / M. Moreno, R. Bataller // Clin. Liver. Dis. — 2008. — Vol. 12. — P. 825-852.

11.    Tammi M.I. Hyaluronan and homeostasis: a balancing act / M.I. Tammi, A.J. Day, E.A. Turley // J. Biol. Chem. — 2002. — Vol. 277. — P. 4581-4584.

12.    Taniguchi M. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride / M. Taniguchi, T. Takeuchi, R. Nakatsuka et al. // Life Sci. — 2004. — Vol. 75. — P. 1539-1549.

13.    Tunon M.J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure / M.J. Tunon, J. Alvarez, J.M. Culebras et al. // World J. Gastroenterol. — 2009. — Vol. 15. — P. 3086-3098.

14.    Wang X.Z. Effects of transmitters and interleukin-10 on rat hepatic fibrosis induced by CCl₄ / X.Z. Wang, L.J. Zhang, D. Li et al. // World J. Gastroenterol. — 2003. — Vol. 9. — P. 539-543.

15.    Weber L.W. Hepatotoxity and mechanism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model / L.W. Weber, M. Boll, A. Stampfl // Crit. Ref. Toxicol. — 2003. — Vol. 33. — P. 105-136.

16.    Wynn T.A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis / T.A. Wynn // J. Pathol. — 2008. — Vol. 214. — P. 199-210.

17.    Wynn T.A. Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various fibroproliferative diseases / T.A. Wynn // J. Clin. Invest. — 2007. — Vol. 117. — P. 524-529.

18.    Yamasaki K. Reactive oxygen species depolymerisation hyaluronan: involvement of the hydroxyl radical / K. Yamasaki, K. Fukuda, M. Matsukawa et al. // Pathophysiol. — 2003. — Vol. 9. — P. 215-220

19.    Zhang L.J. Effects of cytokines on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrogenesis in rats / L.J. Zhang, J.P. Yu, D. Li et al. // World J. Gastroenterol. — 2004. — Vol. 10. — P. 77-81.

20.    Zhang L.J. Effects of interleukin-10 on platelet-derived growth factor expression of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in rat fibrotic liver and culted hepatic stellate cells / L.J. Zhang, Y.X. Cheu, Z.X. Cheu et al. // World J. Gastroenterol. — 2004. — Vol. 10. — P. 2574-2579.

21.    Zhang L.J. Interleukin-10 and chronic liver disease / L.J. Zhang, X.Z. Wang // World J. Gastroenterol. — 2006. — Vol. 12. — P. 1681-1685.