УДК: 616-091.818-06:616.33-006.6

Денисова А.Б., Черданцев Д.В.,Салмина А.Б.,

Жегалов П.С., Малиновская Н.А.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Россия, Красноярский край, Красноярск, Партизана Железняка, 1

КГБУЗ Краевая клиническая больница. Россия, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3а

Особенности апоптоза, экспрессии  AKT, mTOR в слизистой оболочке желудка при предраковых ее состояниях

Резюме. Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается тенденция к снижению количества случаев рака желудка в России и в мире, но вопрос ранней диагностики и своевременного лечения остается актуальным, так как на поздней стадии болезни лечение мало эффективно. Одно из основных мест, в процессеканцерогенеза, принадлежит нарушению механизмов апоптоза,который, в свою очередь, регулируется множеством сигнальных путей, одним из них является путь PI3K/AKT/mTOR.

Ключевые слова: рак желудка, апоптоз, кишечная метаплазия, AKT, mTOR.

Контактное лицо:

Денисова  Анна Борисовна

врач-эндоскопист, КГБУЗ Краевая клиническая больница; адрес: 660022, ул. Партизана 3а; тел: +7 (391) 220-14-99, электронный адрес: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Denisova A.B., Salmina A.B., Cherdancev D.V.,

Zhegalov P.S., Malinovskaya N.A.

Krasnoyarsk State Medical University. 1 Partisana Zheleznyaka street, Krasnoyarsk, Russian Federation Krasnoyarsk Regional Hospital. 3a Partizana Zheleznyaka street, Krasnoyarsk, Russian Federation

Apoptosis, mTOR, AKT expression characteristics in gastric mucosa in precancerous condition presence

Abstract. Background: Lately not only on the territory of RussianFederationbutentireworldthegastriccancermorbidity decreases nevertheless early diagnostic and treatment  are  still actual problems  because  on  the  late  stages  treatment is much less affective. One of the most important places in cancerogenesis belongs to disturbances in apotosis process, which regulates by many pathways including PI3K/AKT/mTOR. The aim of the study was to investigate expression of AKT   and mTOR, apoptosis processes in gastric mucosa in patients with helicobacter-negative gastritis, intestinal metaplasia and gastric cancer.

Key words: gastric cancer, apoptosis, intestinal metaplasia, AKT, mTOR.

Contact person:

Denisova Anna

endoscopist, Krasnoyarsk Regional Hospital; 3a Partizana Zheleznyaka street, 660022, Krasnoyarsk, Russian Federation; ph.: +7 (391) 220-14-99, Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Рак желудка (РЖ) в настоящее время имеет небольшую тенденцию к снижению как во всем мире, так и на территории Российской Федерации (РФ) [5], тем не менее, заболеваемость и смертность остаются высокими, а пятилетняя выживаемость низкой (до 20-30%) [7]. По-прежнему лечение запущенных стадий остается малоэффективным, хотя в РФ большинство опухолей выявляется уже на поздней стадии, когда начинают появляться клинические  симптомы, и пациенты с жалобами обращаются в лечебные учреждения [4]. Оптимальным является выявление рака желудка на ранней стадии, когда имеются только предопухолевые изменения слизистой оболочки желудка (СОЖ) [2]. Так, к ним относят хронический атрофический пангастрит с метаплазией, язвы желудка, аденоматозные полипы желудка [3]. Основными предраковыми изменениями являются гистологически доказанные диспластические изменения СОЖ [12]. Международное агентство по исследованию канцерогенеза (IARC,  Лион)  в  1994  г. определило H. рylori как неизбежный канцерогенный патоген, несмотря на то, что окончательный механизм H. pylori- ассоциированного канцерогенеза не изучен. Почти 90% злокачественных опухолей желудка составляет аденокарцинома, 10% - неэпителиальные опухоли[5]. Кардиальный и некардиальный РЖ являются различными по своей этиологии. Кардиальный рак желудка ассоциирован с хеликобактерным атрофическим гастритом и сходен по патогенезу с некардиалным раком [1 , 9]. Некардиальный рак желудка делится в свою очередь на кишечный и диффузный тип, согласно классификации Lauren. Кишечный тип РЖ характеризуется формированием железоподобных структур, дистальной локализацией и встречаемостью в позднем возрасте. Чаще такой тип рака встречается у мужчин (2:1) и у людей с низким социально-экономическим статусом [8]. РЖ кишечного типа, в соответствии с парадигмой Р. Correa (1975), возникает путем последовательного развития каскада патогистологических изменений, начиная с гастрита, с последующим  появлением  атрофии, кишечной метаплазии, дисплазии  и в финале – аденокарциномы [11]. С другой стороны, диффузный тип характеризуется низкой дифференциацией клеток, встречается у лиц молодого возраста,  ассоциирован  с генетической предрасположенностью. Этот тип рака не связан с формированием предраковых образований слизистой оболочки желудка, встречается одинаково часто среди обоих полов, прогноз у этого типа рака хуже, чем у кишечного [14].

Основная роль в канцерогенезе принадлежит нарушениям процессов апоптоза и, соответственно, нарушениям в сигнальных путях, его регулирующих. Апоптоз играет ключевую роль в тканевом гемостазе, элиминируя клетки, которые больше не выполняют свою функцию. Сегодня существует множество исследований молекулярных механизмов регуляции апоптоза, большая их часть посвящена сигнальному пути PI3K/AKT/mTOR.

Семейство белков PI3K хорошо охарактеризовано в отношении их участия в клеточном цикле, подавлении апоптоза в клетках опухоли. Эта киназа может быть активирована посредством факторов роста на поверхности клетки (например, эпидермальный фактор роста) и играет ключевую роль в регуляции баланса между выживанием клетки и апоптозом. PI3K экспрессируется в цитоплазме, состоит из регуляторной и каталитической субъединицы, участвует в регуляции фундаментальных процессов клеточного ответа [17]. В свою очередь, PI3K регулирует функцию AKT-киназы, чьими мишенями являются транскрипционные факторы, белки семейства bcl-2, проапоптотические каспазы, обеспечивающие выживание клетки и блокирующие апоптоз [10]. Сигнальный путь AKT наиболее часто подвержен гиперактивации среди всех сигнальных путей, вовлеченных в канцерогенез и, является ключевым фактором при развитии многих видов рака путем подавления апоптоза [10]. AKT во- влечен в такие клеточные процессы, как пролиферация, выживание, прогрессия клеточного цикла, клеточный метаболизм, рост, миграция и ангиогенез [6]. Семейство AKT состоит из трех изоформ: 1, 2 и 3. AKT1 играет роль в процессах клеточного роста, AKT2 - в сигнальном пути реакции на инсулин, а AKT3 – в развитии мозга [15]. При высоком уровне экспрессии форфорилированной формы AKT регистрируется плохой прогноз при раке желудка, что связано с ингибированием апоптоза, стимулированием ангиогенеза [16]. AKT регулирует процесс фосфорилирования еще одного участника этого сигнального пути – белка mTOR в составе комплекса mTORC2. mTOR вовлечен во множество клеточных процессов, в реализацию резистентности к инсулину, адипогенез и активацию Т-лимфоцитов. mTOR входит в состав двух комплексов - mTORC1 и mTORC2. mTORC1 регулирует клеточный рост и пролиферацию, стимулируя анаболические процессы (биосинтез белка, липидов и органелл), а также ограничивает такие процессы, как аутофагия. Функция mTORC2 до сих пор до конца не изучена, однако известно, что он участвует в клеточном метаболизме, пролиферации и организации цитоскелета [13]. Активация сигнального пути PI3K/AKT/mTOR происходит под действием факторов роста.

Целью данного исследования было изучение процессов апоптоза в слизистой СОЖ при различных ее состояниях в его связи с участника- ми сигнального пути AKT/mTOR.

 Материалы и методы: на базе НИИ Молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ было проведено исследование биоптатов, полученных в ходе щипцовой биопсии при проведении рутинной гастроскопии. Всего были изучены материалы 29 пациентов, обратившихся в ККБ №1 с целью обследования и лечения. Разрешение на проведение работы было дано этическим комитетом ГБОУ ВПО КрасГ- МУ (№46/2012), заместителем главного врача КГБУЗ ККБ по научной работе. Пациенты были выбраны случайным образом и разделены на три группы на основании данных осмотра и результатов гистологического исследования. Первую группу составили пациенты, у которых в слизистой желудка имелись только явления поверхностного гастрита без  инфицирования  H.pylori  (n=7); вторая группа – пациенты с наличием кишечной метаплазии  (полной и неполной), неинфицированные H.pylori (n=12), а третью группу составили пациенты, у которых по результатам ЭГДС (эзофагогастродуо- деноскопия) с гистологическим подтверждением был выявлен рак желудка: аденокарцинома, перстневидно-клеточный рак (n=10).  Пациенты, у которых были обнаружены явления кишечной метаплазии слизистой желудка, были разделены на тех, у кого метаплазия была полной (n=5) и неполной (n=7). Пациенты с раком желудка были разделены на две группы: аденокарцинома и перстневидно-клеточный рак.

Для оценки процессов апоптоза в тканях использовался метод  TUNEL в депарафинизированных срезах СОЖ с применением “Apo-directkit” (Phoenix flow systems, США). Окрашивание производилось путем нанесения раствора для окраски, приготовленного из очищенной воды, FITC-dUTP, TdT, реакционного буфера, последующей инкубацией при температуре 37°С во влажной камере в течение 60 минут. После промывки наносился раствор пропидия йодида (при разведении 1:5 с буфером, входящим в набор) и срезы инкубировались во влажной камере в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. После чего сразу производилась микроскопия.

Для оценки экспрессии mTOR и AKT применялся непрямой метод иммуногистохимии с флуоресцентным мечением вторичными антителами. В работе использова- лись антитела anti-mTOR (ab87540, Abcam, Великобритания) в разведении 1:250, а также антитела Anti- Akt1/2 (OAED00023, Antibody Aviva Systems Biology, США) в разведении 1:250. Для флуоресцентного мечения использовались вторичные антитела Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor 555 (ab150078, Abcam, Великобритания), Goat Anti-Mouse IgG H&L Alexa Fluor 488 (Abcam, Великобритания) в разведении 1:500. Для окрашивания ядер использовался 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), (Sigma-Aldrich, США). Окрашивание срезов происходило в два этапа. На первом этапе производилось блокирование неспецифического связывания сывороткой и нанесение первичных антител на депарафинизированные срезы на 18 часов при температуре 4°С. На втором этапе производилось нанесение вторичных антител с инкубацией срезов при температуре 37°С. Затем на срезы наносилась монтирующая жидкость с красителем для ядер DAPI, после чего препарат накрывался покровным стеклом и производилась микроскопия.

Полученный материал оценивался при помощи конфокального микроскопа Fluoview, Olympus, Япония. Оценка уровня апоптоза производилась путем расчета индекса апоптоза  (ИА),  который  подсчитывался следующим образом: число TUNEL-позитивных клеток, деленное на общее количество ядер клеток в поле зрения и умноженное на тысячу. Оценивался коэффициент экспрессии AKT и mTOR путем подсчета количества клеток, экспрессирующих mTOR и AKT на 1000 клеток. 

Статистическая обработка материала производилась при помощи программы StatPlus 5.9.8, использовался метод непараметрической статистики, тест Манна-Уитни, оценивалось процентильное соотношение в группах, оценивались средние значения в группах и статистически значимое различие между ними (p<0,05).

Результаты: из 29 пациентов, жалобы на боли в эпигастрии, тяжесть после приема пищи, вздутие, снижение аппетита предъявляли 17 пациентов, значительная  часть  (n=7) с раком желудка. Остальные пациенты были отправлены на исследование как обязательное в плане обследования по основному заболеванию. По половой принадлежности в группах исследования было 14 женщин, 15 мужчин. Средний возраст составил 66 лет.

Мы обнаружили, что в группе пациентов с гастритом среднее значение ИА составило 11,15. У пациентов, у которых по результатам гистологического исследования была выявлена кишечная метаплазия, ИА варьировал, и среднее его значение составило 14,80, в подгруппе с полной метаплазией - 16,51, а с неполной - 13,58. У пациентов, у которых в ходе исследования был обнаружен РЖ, среднее значение ИА составило 6,83. Корреляции с возрастом и полом не было [Рис. 1].

При оценке коэффициента экспрессии mTOR и AKT статистически значимое различие было найденов группах «гастрит» и «рак» (p<0,05), а также между группами «гастрит» и «метаплазия» (при отсутствии деления  на  полную  и   неполную).

Деление на полную и неполную метаплазию проводилось на основании морфологической картины и описания морфологической картины в протоколе патологоанатомического заключения. Среднее значение коэффициента mTOR вгруппе «гастрит» составило 53,03, в группе

«рак» - 116,99, а в группе «метаплазия» - 117,07. При оценке экспрессии AKT в группе «метаплазия» различалось четкое деление на две группы. При этом былообнаружено между ними статически значимое различие (p<0,05), а также между двумя группами и «раком». Среднее значение коэффициента AKT в группе «гастрит» составило 158,06, в группе «рак» - 159,41, а при делении на две группы пациентов с метаплазией СОЖ составил,соответственно, 217,70  и 79,16 [Рис. 2].

Обсуждение.  Уровень   апоптоза в тканях слизистой желудка при раке желудка достоверно ниже (p=0,025), чем при кишечной метаплазии и гастрите, чтосоответствует неконтролируемой клеточной пролиферации. Некоторое повышение ИА при кишечной метаплазии может быть объяснено гибелью клеток как реакцией на длительно существующий воспалительный процесс. Между группой пациентов, у которых были выявлены явления гастрита, и тех, у кого выявлена кишечная метаплазия, были обнаружены различия (но они не достигали статистически значимого значения) в показателях ИА и изменении распределения ИА внутри группы, что подтверждает нарушения процессов клеточного обновления при кишечной   метаплазии.   У  пациентов с полной кишечной метаплазией показатели  увеличивались,  а в группе с неполной метаплазией отмечались различные значения, которые совпадали с показателями при полной метаплазии, при гастрите. Данная картина может быть интерпретирована как тенденция к снижению ИА после его подъема, ослаблению защитных механизмов СОЖ и, следовательно, предпосылками к развитию злокачественной опухоли. Эти измененияэкспрессии могут быть связаны с нарушением экспрессии белка mTOR, регуляторная роль которого в канцерогенезе является доказанной, и в меньшей степени - с изменениямиAKT.

Выводы:

Для гастрита без хеликобактерного инфицирования был характерен средний уровень ИА и низкий уровень экспрессии mTOR, при метаплазии слизистой отмечалось как повышение ИА, так и уровня экспрессии mTOR, а при раке желудка ИА значительно снижался, а экспрессия mTOR оставалась на высоком уровне. Это позволяет предположить, что дизрегуляция процессов апоптоза и mTOR-регулируемых механизмов пролиферации, играет важную роль в прогрессии предраковых состояний СОЖ.

Исследование выполнено при поддержке Краевого государственного   автономного  учреждения

«Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-техническойдеятельности»,проект№01/13 от 21.06.13, а также приподдержке «Фонда содействию малых форм предприятий в научно-технической сфере», проект №0011745. 

Литература

1.     Айталиев М.С. Особенности клинических проявлений рака проксимального отдела желудка с инфильтрацией кардии и пищевода / Айталиев М.С., Земляной В.П., Непомнящая С.Л., Лисицын А.А. // Сибирскоемедицин- ское обозрение. – 2004. – T. 4, № 33. C.24-26.

2.   Бектаева Р.Р. Современные подходы к диагностике и лечению предраковых заболеваний желудка / Бектаева Р.Р., Бенберин В.В. // Дневник казанской медицинской школы –2016. – Т. 12, № 2. – С.11-13.

3.   Волкова Н.Н. Факторы риска развития хронического атрофического гастрита (литературный обзор) // РМЖ. – 2013. – T.   № 31. C.1617-1621.

4.    Котелевец С.М. Как проводить скрининг и профилактику предраковых состояний желудка? По итогам программы по скринингу и профилактике предраковых состояний желудка, реализующейся в Карачаево-Черкесской Республике (практические рекомендации) // Дневник казанской медицинской школы. – 2014. – Т. 4, № 1. – С.11-15.

5.   КотелевецС.М.Перспективасерологическогоскринингаатрофического гастрита в России / Котелевец С.М. // Дневник Казанской медицинской школы. – 2013. № 1. – P.24-26.

6.  Almhanna K. Targeting AKT protein kinase in gastric cancer / Almhanna K., StrosbergJ.,MalafaM.//AnticancerRes.–2011.–Vol.31,№12.–P.4387-4392.

7.  BosmanF.T.WHOclassificationoftumoursofthedigestivesystem/Bosman F.T. – Lyon: IARC Press. – 2010. – 417 с.

8.   Castano-Rodriguez N. Pattern-recognition receptors and gastric cancer / Castano-Rodriguez N., Kaakoush N.O., Mitchell H.M. // Front Immunol. –    2014. – Vol. 5. – P. 336.