УДК: 616-093/-098:616-095
1Родионов Г.Г., 1Шантырь И.И., 1Дударенко С.В., 2Фоминых Ю.А., 1Светкина Е.В., 1Сарьян Э.С.
20ommi x Œ.A., 1Cbetkmia E.B., 1Capaei E.C.
1ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России. 194044,
г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева 4/2.
2ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» МЗ РФ 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8.
Результаты исследования пристеночной микробиоты кишечника пациентов при дислипидемии
Резюме. Актуальность проблемы. По статистике, сосудистые заболевания являются одной из лидирующих причин смертности населения. Как известно, возникновение сосудистых заболеваний связано с нарушениями липидного обмена в сторону повышения уровней холестерина (ХС), липопротеидов низкой (ЛПНП), очень низкой плотности (ЛПОНП) и триглицеридов (ТГ). Одним из предположений, находящимся на стадии изучения, является то, что видовой состав микробиоты кишечника связан с нарушениями липидного обмена. В связи с этим, несомненна актуальность проблемы атерогенной дислипидемии и ее возникновения на фоне дисбиоза кишечника.
Ключевые слова: микробиота, липидный обмен, холестерин, хроматография.
Контактное лицо:
Родионов Геннадий Георгиевич
д.м.н., заведующий НИЛ Токсикологии и лекарственного мониторинга ФГБОУ "ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова" МЧС России. 194-44, г. Санкт-Петербург, ул. Оптиков, 54. Тел.: 8 (921) 307- 02-79, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.
1Rodionov G.G., 1Shantyr I.I., 1Dudarenko S.V.,
2Fominykh Y.A., 1Svetkina E.V., 1Saryan E.S.
1The Federal State Budgetary Institute «The Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine» The Ministry of Russian Federation for Civil Defense, Emergencies and Elimination of Consequences of Natural Disasters. 194044, St. Petersburg, Akademika Lebedeva str. 4/2.
2Pavlov First Saint-Petersburg State Medical University.L’vaTolstogo str. 6-8, 197022, Saint- Petersburg, Russia.
Results of the investigation of patient’s parietal intestinal microbiota suffering from dyslipidemia
Abstract. Background. Cardiovascular diseases are one of the leading causes in population death according to statistics.As is known, the occurrence of cardiovascular diseases is associated with lipid disorders in the way of increasing cholesterol, low and very low-density lipoproteins and triglycerides. One of the theories which many scientists are investigating is that species composition of intestinal microbiota is associated with lipid metabolism disorders. As a result, the relevance of the problem of atherogenic dyslipidemia and its occurrence against the background of intestinal dysbiosis is undoubtedly important.
Key words: microbiota, lipid metabolism, cholesterol, chromatography.
Contact person:
Rodionov Gennadiy Georgievich
d.m.s ., the Head of research laboratory of Toxicology and Drug monitoring of The Federal State Budgetary Institute
«The Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine» The Ministry of Russian Federation for Civil Defense, Emergencies and Elimination of Consequences of Natural Disasters, 54 Optikov St., St. Petersburg, Russian Federation, 194044, tel. 8(921)307-02-79, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.
Актуальность проблемы. В настоящее время, исследователи все больше заинтересованы в поиске дополнительных факторов патогенеза заболеваний сердца и сосудов. Одним из предположений, находящимся на стадии изучения, является то, что видовой состав микробиоты кишечника, его дисбаланс, прямо или опосредованно через угнетение функции печени, связан с нарушениями липидного обмена. По литературным данным, нарушения кишечной микробиоты выявляются у 90% больных сердечно-сосудистыми патологиями [16, 19, 20].
Подтверждаются слова Гиппократа, сказанные еще за 400 лет дон. э., что «смерть сидит в нашем кишечнике» и что «плохое пищеварение – путь ко всем болезням» [цит.по 25]. В результате развития современных молекулярно-генетических методов исследования удалось показать, что дисбиоз, или имбаланс(нарушение равновесия) состава микробиоты является одним из главных факторов развития различных заболеваний человека [13, 18].В настоящее время не вызывает сомнений, что взаимосвязь микробиоты кишечника с нарушениями липидного обмена существует. Еще в 1907 году было первое упоминание Мечникова И.И. о роли нарушений дисбиоза кишечника в процессах атерогенеза. Профессор Арчаков А.И. в своих трудах подчеркивал роль дисбиоза в патогенезе атерогенной дислипидемии, а Ю.В. Конев описал эндотоксин – индуцированный механизм атерогенеза [цит. по 4].
Некоторые современные исследователи также указывают на существование данной связи [2, 5, 14, 29]. Ряд авторов [11, 23] описали своеобразный порочный круг:
- нарушение микроэкологии кишечника - накопление эндотоксинов
- нарушение энтерогепатической циркуляции желчных кислот - нарушение функции печени - нарушение обмена липидов - поддержание (или усугубление) нарушенного кишечного дисбиоза.
Применяемые сегодня в клинической практике методы определения микроэкологического статуса имеют определенные ограничения и недостатки. Например, существенным недостатком классического бактериологического исследования, помимо длительности (7-10 дней), является невозможность оценить роль некультивируемых микроорганизмов в инфекционно-воспалительном процессе, прежде всего – анаэробов. Используемый в качестве дополни- тельного к классическому иммуно-серологический метод является непрямым, поскольку выявляет не возбудителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации. Известные молекулярно-биологические методы, при несомненных преимуществах - прямое определение возбудителя, высокие специфичность и чувствительность, универсальность, скорость, возможность диагностики хронических и латентных инфекций – имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные результаты и невозможность адекватной количественной оценки [4, 22]. Из всего изложенного вытекает очевидная востребованность в надежном количественном экспресс-методе оценки микробиоты кишечника.
Таким методом является хемо- дифференциация микроорганизмов с помощью газовой хроматографии (ГХ-МС), основанная на количественном определении маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов). Этот метод как медицинская технология позволяет не только проводить мониторинг этих соединений в образцах, но также и рассчитывать численность микро- организмов того или иного таксона в образце. В этом принципиальное отличие метода, придающее ему качественно новое свойство – возможность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров, что позволяет оценить вклад от каждого из сотен видов микроорганизмов, присутствующих, напри- мер, в фекалиях [26, 28].
Предлагаемый метод газовой хроматографии, совмещенной с массспектрометрией (ГХ-МС) позволяет детектировать в исследуемых образцах маркеры, компоненты клеток широкого спектра микроорганизмов нормальной и патогенной микробиоты человека. Метод ГХ-МС обеспечивает возможность детектировать одновременно множество маркеров микроорганизмов при проведении анализа одного образца. Внедрение ГХ-МС позволяет сократить время и стоимость исследования, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. Метод позволяет не только определять маркерные вещества (жирные кислоты, альдегиды, спирты и стерины) в чистых культурах микроорганизмов, выделенных из клинического материала [21], но и выявлять и количественно определять состав микробного сообщества, который кроется за набором маркеров конкретной пробы [9, 30].
В 2010 году Росздравнадзором разрешено его применение в качестве новой медицинской технологии «Оценки микроэкологического статуса человека методом хромато- масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).
Цель работы. Изучить особенности пристеночной микробиоты кишечника у пациентов с дислипидемией.
Материал и методы. Методом сплошной выборки отобраны 94 пациента с различной соматической патологией, проходивших стационарное обследование и лечение в клинике ВЦЭРМ им. А.М.Никифорова МЧС России. Возраст обследованных 55 - 65 лет.
С целью выявления нарушений липидного обмена в сыворотки крови на биохимическом анализаторе «DxC 600» («Beckman-Coulter», США) определяли: общий холестерин (ХС), липопротеиды высокой (ЛПВП), низкой (ЛПНП) и очень низкой (ЛПОНП) плотности и триглицериды (ТГ).
Оценку состояния пристеночной микробиоты кишечника определяли на газовом хроматографе «Agilent 7890» с масс-селективным детектором «Agilent 5975С» («AgilentTechnologies», США). Объединенные статистические показатели пристеночной микробиоты кишечника (общее количество клеток, полезная микрофлора (ПФ), условно патогенная микрофлора (УПатФ), базировались на данных публикации [10].
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью пакета статистических программ Статистика 6,0 в том числе описательная статистика, непараметрическое сравнение с использованием критериев Краскела-Уоллеса и Манна-Уитни, многомерные регрессии и корреляции. Значения оценивались значимыми на уровне 0,05.
Результаты и их обсуждение. В статье представлены только те результаты, по которым установлена статистически значимая связь или статистически значимые различия в группах сравнения.
Результаты определения показателей липидограммы сывороткикрови обследованных пациентов(94 чел.) представлены в таблице 1.Статистические показатели при-стеночной микробиоты кишечника обследованных пациентов (94 чел.)
представлены в таблице 2.
Полученные результаты липидограммы сыворотки крови пациентов были проанализированы для оценки возможной статистической связи отдельных показателей липидного обмена, проявляющейся дислипидемией, типом дислипидемии (IIа и IIб) с количественным и качественным составом пристеночной микрофлоры кишечника.
В таблице 3 представлены статистические данные о достоверном различии отдельных представите- лей пристеночной микробиоты кишечника у пациентов с нормальны- ми и повышенными показателями концентрации холестерина в сыворотке крови.
Установлено, что у пациентов с повышенным уровнем ХС в сыворотке крови выявлялось большее количество микробных маркеров Lactobacillus и Rhodococcus в мукозном слое кишечника. При сопоставлении групп лиц с нормальным и повышенным уровнем общего холестерина сыворотки крови наиболее значимые ранговые корреляции Спирмана на уровне 0,05 установлены для Lactobacillus(0,341) и Blautia coccoides (- 0,352). Это отражено на рисунке № 1. Менее значимые корреляции выявлены для следующих групп бактерий: Clostridium hystolyticum (0,237), Rhodococcus (0,278), Staphylococcus intermedium (0,249).
Следует обратить внимание на тот факт, что у пациентов с повышенным содержанием обще- го холестерина в сыворотке крови количество аэробных бактерий в пристеночном слое кишечника значимо больше, что является одним из признаков дисбиоза кишечника и отражено на рисунке № 2 [7].
Анализ состава пристеночной микробиоты кишечника у пациентов с нормальным и повышенным уровнем в сыворотке крови ЛПНП показал, что количество микробных маркеров Lactobacillus с высокой степенью достоверности (р = 0,037) больше у пациентов с избыточным содержанием в крови ЛПНП.
В таблице 4 представлены статистические данные о достоверном различии отдельных показателей пристеночной микробиоты кишечника у пациентов с нормальным и повышенным уровнем в сыворотке крови ЛПОНП.
Установлено, что у пациентов с повышенным уровнем ЛПОНП в сыворотке крови выявлялось увеличение количества микробных маркеров Lactobacillus, Clostridium histoliticus и ramosum, Rhodococcus, а также снижение количества микробных маркеров Propionibacter./ Cl.subterminale. Особенность данной группы пациентов заключается и в том, что помимо перечисленных отдельных представителей микро- организмов (в основном анаэробы) у них достоверно повышено общее
количество условно-патогенной ми- крофлоры кишечника (р = 0,040) и, особенно, содержание аэробов (р = 0,008), что характерно для дисбиоза кишечника.
При сравнении двух групп пациентов: с показателями липидограммы (за исключением ЛПВП) в пределах референтных величин (группа 1 - 56 человек) и с выявленной дислипидемией в сыворотке крови (30 человек), установлено, что у пациентов с дислипидемией статистически значимо больше в мукозном слое кишечника микробных маркеров Lactobacillus (р = 0,006) и Rhodococcus (р = 0,014);
Для дальнейшего анализа все обследованные с выявленной дислипидемией были распределены по классификации Фредриксона на две группы:
- группа IIа – тип дислипидемии, при которой повышен ХС и ЛПНП (14 человек);
- группа IIб – тип дислипидемии, при которой повышен ХС и ТГ (16 человек).
У 8 человек выявлено отклонение только отдельных показателей, что не позволило включить этих лиц в дальнейшее исследование.
При статистическом анализе возможной связи состава микробных маркеров пристеночной микробиоты кишечника от типа дислипидемии с использованием критерия Краскела-Уоллиса выявлено, что из 57 микробных маркеров только три из них по количеству, статистически значимо отличаются в группах сравнения, данные представлены в таблице 5.
Так, количество микробных маркеров Clostridium ramosum в группе пациентов с типом дислипидемии IIб было выше, чем в остальных группах. При этом количество микробных маркеров Lactobacillus и Rhodococcus в группе пациентов с типом дислипидемии IIа было выше только по отношению к показателям 1 группы пациентов. Количество микробных маркеров условно-патогенной микрофлоры у пациентов в группе с дислипидемией типа 2б статистически достоверно больше согласно критерия Краскела-Уоллиса (р = 0,0148), чем у остальных обследованных, а количество микробных маркеров аэробов больше по сравнению с пациентами с нормальной липидограммой сыворотки крови.
В научной литературе, посвященной взаимодействию кишечной микробиоты и липидного обмена, описано несколько возможных механизмов.
Так,в 2001 году М. Карнейро де Мур апатогенетически обосновал участие микробиоценоза толстой кишки в качестве одного из звеньев нарушений холестеринового метаболизма: холестерин, под действием микроорганизмов толстого кишечника последовательно метаболизируется в копростанол / копростанон и частично выводится с калом. В свою очередь, при активации реакции брожения в кишечнике копростанол и копростанон выделяют ацетат и пропионат, которые всасываются в кровь и, достигнув печени, оказывают разнонаправленное действие на синтез холестерина: ацетат его активирует, а пропионат – угнетает [цит. по 19].
Ряд авторов [3, 8] считают, что дисбиотические сдвиги в кишечнике сопровождаются повышенной деконъюгацией желчных кислот с образованием их токсичных солей и повышением реабсорбции до 100%. В результате синтез желчных кислот уменьшается, а метаболизм печени переключается на синтез холестерина.
В свою очередь некоторые исследователи [2, 15, 19] придают большое значение изменению ph в кишечнике, которое возникает вследствие недостатка пребиотических компонентов в питании, нарушающий рост нормальной микрофлоры,в том числе бифидо - и лактобактерий [17]. При повышении значений pH дезоксихолевая кислота ионизируется и хорошо всасывается в толстой кишке, а при снижении - выводится. Всасывание дезоксихолевой кислоты обеспечивает не только пополнение пула желчных кислот в организме, но, также, является важным фактором,стимулирующим синтез холестерина.
Исследователи [1, 12, 24] полагают, что удаление холестерина из среды культивирования бифидобактериями и лактобациллами не связано с поглощением холестерина, а является результатом деконъюгации его желчных солей.
Выявленные в нашем исследовании изменения количественного и качественного состава микро- биоты кишечника у пациентов с нарушением липидного обмена детализируют литературные данные в отношении Lactobacillus и дают возможность по-новому оценить степень влияния отдельных представителей анаэробов (Clostridium histoliticus и ramosum, Propionibacter./Cl.subterminale) и аэробных актиномицетов – Rhodococcu sна данные процессы.
Изменение количественного состава нормобиоты кишечника у обследуемых (повышение количества Lactobacillus на фоне снижения количества Propionibacter./ Cl.subterminale при сохраненном количестве Bifidobacterium), увеличение общего количества условно-патогенной флоры кишечника (особенно семейства клостридий с их способностью к токсинообразованию и локальному повреждению тканей за счет выработки ряда протеолетических ферментов) и отдельно аэробных актиномицетов создают, по нашему мнению, условия для возникновения и последующего развития дислипидемии в организме человека.
Только при оптимальных количественных и качественных взаимоотношениях микроорганизмов, формируются наиболее благоприятные условия для жизнедеятельности организма человека в целом. Когда нормальные соотношения в микробиоценозах человека изменяются, в результате нарушаются защитные, метаболические, регуляторные свойства микробиоты.
Выводы.
Проведенное исследование пристеночной микробиоты кишечника методом хромато-масс- спектрометрии микробных маркеров у пациентов с дислипидемией свидетельствует о наличии у обследуемых определенных взаимосвязей между количественным со- ставом микробиоты кишечника и показателями липидного обмена:
У пациентов с дислипидемией в мукозном слое кишечника содержание микробных клеток видов Lactobacillus и Rhodococcus статистически достоверно больше;
Наиболее значимая статистическая связь этих видов микроорганизмов установлена по отношению концентрации общего холестерина сыворотки крови;
У пациентов с повышенным уровнем ЛПОНП в сыворотке крови наблюдалось увеличение количества микробных маркеров Lactobacillus, Clostridium histoliticus и ramosum, Rhodococcus на фоне снижения количества Propionibacter./ Cl.subterminale;
В группе пациентов с IIб типом дислипидемии общее количество условно-патогенной микрофлоры в том числе микроорганизмов Clostridium ramosum статистически достоверно больше, чем у остальных обследованных, а в группе с IIа типом дислипидемии содержание микроорганизмов Lactobacillus и Rhodococcus достоверно больше только по отношению к показателям лиц с нормальной липидограммой. Для пациентов с нарушенным обменом холестерина характерно повышенное содержание в кишечнике аэробных бактерий, что характерно для дисбиоза.
Литература
1. Бондаренко С.М. Роль кишечной микробиоты в обмене холестерина и рециркуляции желчных кислот / Бондаренко С.М., Рыбальченко О.В., Ерофе- ев Н.П. // Лечение и профилактика. – 2013. - № 3. – С. 65 - 73
2. Звенигородская Л.А. Гиполипидемическая терапия у больных с не- алкогольной жировой болезнью печени. / Звенигородская Л.А., Самсонова Н.Г., Мельникова Н.В., Черкашова Е.А. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2010. – №7. – С. 25-33.
3. Иванченкова Р.А. Патогенез холестероза желчного пузыря: обзор. / Иванченкова Р.А., Свиридов А.В. //Клиническая медицина. – 2002. - № 2. – С. 14 – 19.
4. Конев Ю.В. Метаболизм эндотоксина в организме и его роль в процессе инволюции. /Конев Ю.В., Лазебник Л.Б. // Клиническая герантология – 2009 – Т.15, №1. – С.39 – 46.
5. Лазебник Л.Б. Метаболический синдром и органы пищеварения. / Лазебник Л.Б., Звенигородская Л.А. - М.:Анахарсис, 2009. – 183 с.
6. Михайлова Д.О. Диагностическое значение различных иммунологических методов лабораторной диагностики легионеллеза. / Михайлова Д.О., Бобылева З.Д., Базарный В.В., Амон Е.П., Бейкин Я.Б., Беседина Л.Т., Мель- никова О.В., Шилова В.П., Розанова С.М., Перевалова Е.Ю. // Журн. микро- биол., эпидемиол. Иммунобиол. – 2008. - № 2. – С.. 51-53.
7. Немцов В.И. Нарушения состава кишечной микрофлоры и метаболи- ческий синдром. / Немцов В.И. // Клинико-лабораторный консилиум. – 2010. - № 1. – С. 4 – 13.
8. Осипов Г.А. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов./ Осипов Г.А. // Патент РФ № 2086642. С12N 1/00, 1/20, C12Q 1 /4, 24.12.1993.
9. Осипов Г.А. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микро- организмов в анаэробных инфекционных процессах. / Осипов Г.А. Демина А.М. // Вестник РАМН. – 1996. - Т.13. - № 2. - С. 52-59.
10. Осипов Г.А. Хромато-масс-спектрометрический анализ микроорга- низмов и их сообществ в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах. / Осипов Г.А. // Химический анализ в медицинской диагностике. – М.: Наука, 2010. – С. 293 – 368.
11. Петухов В.А. Нарушение функций печени и дисбиоз при липидномди- стресс-синдроме и их коррекция пробиотикомХилак-форте. / Петухов В.А. // Российский медицинский журнал. – 2002. - № 4. – С. 77-89.
12. Протасов К.В. Изменение кишечной микрофлоры и ее холестерин превращающих свойств под влиянием молочнокислых продуктов «Бифи- вит» и «Ацидолакт». / Протасов К.В., Кустос В.С., Сайфутдинов Р.Г. // Сибир- ский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - Томск, 1997. - Том 1. - № 4-5. - С. 243.
13. Протасов К.В. Дисбактериоз кишечника у больных ИБС. / Протасов К.В., Сайфутдинов Р.Г. // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатоло- гии, Томск. - 1998. – Т. 1. - № 6-7. - С. 367-368.
14. Сайфутдинов Р.Г. Состав кишечной микрофлоры и ее холестерин пре- вращающие свойства у больных ИБС. / Протасов К.В., Тарабрин А.Л., Хмель Т.В. // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии, 1996. – Т. 1. - № 3. С. 146.
15. Сайфутдинов Р.Г. Кислотность среды и жизнедеятельность бифидо- бактерий в системе in vitro. / Сайфутдинов Р.Г., Кустос В.С., Леонтьева А.Г., Попкова С.М., Сафронова И.Ю. // Российский гастроэнтерологический жур- нал. - 1997. - № 4. - С. 122.
16. Самсонова Н.Г. Дисбиоз кишечника и атерогенная дислипидемия. / Самсонова Н.Г., Звенигородская Л.А., Черкашова Е.А., Лазебник Л.Б. // Экс- периментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2010. - № 3. – С. 88 – 94.
17. Ткаченко Е.И. Питание, микробиоценоз и интеллект человека. / Тка- ченко Е.И., Успенский Ю.П. - СПБ.: СпецЛит, 2006. - С. 196 - 233.
18. Ткаченко Е.И. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и ле- чению. – 2-е изд., испр. и доп. / под ред. Е.И.Ткаченко, А.Н.Суворова. – СПб.: ИнформМед, 2009. – 276 с.
19. Шилов А.М. Эндобиоценоз кишечника и метаболически – ассоции- рованные состояния. / Шилов А.М., Марьяновский А.А., Петрухина Н.Б. // Лечебное дело. - 2013. - № 2. – С.67 – 74.
20. Albert M.A. Effect of Statin therapy on C-reactive protein levels. The Pravastatin inflammation / CRP Evaluation (PRINCE): A Randomized Trial and colort Study. / Albert M.A., Danielson E., Rifai N. // JAMA. – 2001. – v. 28(6). - P.64-70.
21. Вейант Р. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицатель- ных бактерий. / Вейант Р., Мосс У., Холлис Д., Джордан Дж., Кук Э., Дейншвар М. - М.: Мир, 1999. - С. 612-783.
22. Fenollar F. Analysis of 525 samples to determine the usefulness of PCR amplification and sequencing of the 16S rRNA gene for diagnosis of bone and joint infections. / Fenollar F., Roux V., Stein A., Drancourt M., Raoult D. // J. Clin. Microbiol. – 2006. - v. 44. - № 3. - P. 1018-1028.
23. Kim M. The experimental study of hepatocytotoxity in endotoxemia. / Kim M., Onda M.,Yoshimura S. // J. Germfree life gnotobiol. - 1991. - v 21. – N 2. - P. 37 -42.
24. Klaver E.A. The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacillus and Bifibacteriumbifidum is due to their bile – deconjugating activity. / Klaver E.A., van der Meer K. - 1993. - v. 59. - №4. - P. 1120 -1124.
25. Hawrelak J.A. The causes of intestinal dysbiosis: a review. / Hawrelak J.A., Myers S.P. // Altern. Med. Rev. – 2004. - v. 9. - P. 180 – 197.
26. Luckey T.D. Overview of gastrointestinal microecology. / Luckey T.D. // Nahrung. – 1987. – v. 31. - № 5-6. - P. 359-364.
27. Persing D.H. Polymerase chain reaction: trenches to benches. / Persing D.H. // J. Clin. Microbiol. – 1991. - v. 29. - № 7. - P. 1281-1285.
28. Suau A. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. / Suau A., Bonnet R., Sutren M., Godon J.J., Gibson G.R., Collins M.D., Doré J. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – v. 65. - № 11. - P. 4799 – 4807.
29. Wang Z. Gut flora metabolism of phosphatidilcholine promotes cardiovascular disease. / Wang Z., Klipfell E., Bennet B.J. // Nature. - 2011. - v. 472. - P. 57 – 63.
30. White D.C. Validation of quantitative analysis for microbial biomass, community structure, and metabolic activity. / White D.C. // Adv. Limnol. – 1988. - № 31. - P. 1-18.
