УДК: 616-073.755.4

1АХАТОВ А.Ф., 2ЛЮБОВЦЕВ В.В., 3АНИСИМОВ В.И., 4АХМЕТХАНОВ С.Р., 5ИСМАГИЛОВА Р.Р., 6РЫЖКИН С.А., 7МИХАЙЛОВ М.К.

1,4,6,7КГМА - филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова 36
2,3ДЦ ООО «БАРСМЕД», 420101, г. Казань ул. Хусаина Мавлютова, 2
5ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49

Современные аспекты применения контрастных средств для магнитнорезонансной томографии в клинической практике

Резюме. На сегоднящний день существует большое количество различных магнитно-резонансных контрастных (МР-контрастных) препаратов и ведется разработка новых, которые в зависимости от типов молекул подразделяются на парамагнитные,
например, содержащие гадолиний, и суперпарамагнитные, содержащие частицы оксида железа. Чтобы использовать оптимально то или иное контрастирующее средство в разных клинических случаях, уверенно оценивать их безопасность и эффективность, необходимо знать особенности структуры и механизма действия каждого препарата.

Ключевые слова: МР-контрастные препараты, релаксивность, парамагнитные ионы, суперпарамагнитные частицы, безопасность, стабильность, специфичность.

Контактное лицо:

Рыжкин Сергей Александрович
кандидат медицинских наук, доцент кафедры лучевой диагностики КГМА -
филиала ФГБОУ ДПО РМАНПО Министерства здравоохранения России, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова 36,
Телефон: (843) 233-34-95, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Abstract. There is a large number of magnetic resonancecontrast (MR-contrast) preparations, as well as research on the development of new ones, which, depending on the types of molecules, are divided into paramagnetic, for example gadolinium and superparamagnetic, for example, iron oxide particles. To know which of them should be used in particular clinical cases, it is necessary to disassemble and study each separately. Understanding such characteristics as relaxivity, stability, specificity allows us to confidently assess the safety and efficacy of MR contrast preparations.

Key words: MR-contrast preparations, relaxivity, paramagnetic ions, superparamagnetic particles, safety, stability, specificity.

Contact person:

Ryzhkin Sergey Aleksandrovich
candidate of medical sciences, аssociate professor of the Department of Radiology of KSMA -
branch of FGBOU DPO RMANPO of the Ministry of Health of Russia, 420012, Kazan, ul. Butlerova 36,
Phone: (843) 233-34-95, e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Введение. МР-контрастные препараты являются важной составной частью в диагностическом процессе МР-исследования и позволяют выявлять и дифференцировать очаги структурных изменений при различных патологических процессах органов и тканей пациента. В клинической практике проводят исследования с контрастным усилением в основном для выявления и дифференциации доброкачественных и злокачественных новообразований, воспалительных заболеваний аутоиммунного и инфекционного генеза, патологических изменений сосудов при контрастной ангиографии, оценки распространения и тяжести ишемического поражения при проведении перфузионного исследования.
Для понимания особенностей каждого МР-контрастного препарата следует знать его воздействие на магнитные свойства тканей, основным механизмом которого является изменение времен МР-релаксации. Релаксация - это возвращение системы спинов в состояние равновесия в магнитном поле после резонансного радиочастотного импульса. Влияние на этот процесс приводит к изменению интенсивности, яркости и контрастности тканей, накопивших контраст, что позволяет увеличить выявляемость патологических изменений, повысить диагностическую точность, чувствительность и специфичность метода. Основными критериями выбора МР-контрастного препарата в настоящее время являются безопасность применения, определяемая стабильностью введенного в кровоток вещества, специфичность и стоимость. Основной проблемой применения контрастных средств является возможность разрушения молекулы при введении в кровоток с выделением свободного гадолиния, обладающего токсическими свойствами, влекущим за собой целый спектр возможных побочных реакций, наиболее ярко проявляющихся нефротоксичностью, что ограничивает их применение в диагностике у пациентов, в первую очередь с заболеваниями почек.

Усовершенствование МРконтрастных препаратов приводит к увеличению стабильности препарата, снижая вероятность разрушения несущей молекулы до свободного гадолиния в кровотоке, уменьшает токсичность препарата и увеличивает интенсивность накопивших контрастное средство тканей. МР-контрастные препараты в зависимости от видов молекул делятся на два класса: парамагнитные, например, гадолиний, и суперпарамагнитные, например, частицы окиси железа.
Гадолиний-содержащие контрастные агенты (GBCA) по химической структуре делятся на линейные и макроциклические. Они также сгруппированы в соответствии с их физическим свойством на ионные или неионные [6].
Суперпарамагнитные частицы представляет собой класс контрастных агентов МРТ, состоящих из ядра железа (Fe3+) и железа (Fe2+) [16], покрытого слоем полимера (декстран, карбоксидекстраны, полиэтиленгликоль) или мономерами (цитраты), что обеспечивает наилучшую толерантность и предотвращает агрегацию in vivo [5], что является признаком стабильности и безопасности препаратов данного класса.
В соответствии с биораспределением в организме МР-контрастные препараты различают на неспецифические внеклеточные и тканеспецифические [6]. Основная часть Свободный ион гадолиния (Gd3+) является токсичным [8]. Его ионный радиус (108 мкм) очень близок к ионному радиусу кальция (Ca2+ (114 мкм)). Отсюда следует, что свободный гадолиний является конкурентным ингибитором физиологических процессов, которые зависят от притока Са2+, включая каналы и активность некоторых ферментов[15]. Хелатирование с помощью подходящего органического лиганда, также известного как хелатор, такого как диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), значительно снижает свободную токсичность Gd3+. Эксперименты с острой токсичностью показывают, что 50% летальная доза (LD50) свободных ионов Gd3+ в 50 раз выше, чем у хелатированного гадолиния. Хелатор защищает ткани от взаимодействия с ионами Gd3+ и позволяет ускорить почечную экскрецию ионов Gd3+ и свести к минимуму биотрансформацию или накопление в организме[8]. Таким образом, чтобы не допустить нежелательных реакций организма, необходимо ввести ион гадолиния в хелатированное состояние. Для обеспечения диагностической эффективности и безопасности препарата наиболее важными из различных физико-химических свойств являются безопасность, релаксивность и стабильность [18]. 

Первым препаратом на рынке МР-контрастных средств стал Magnevist, который был зарегистрирован в 1988 году. Это был огромный прорыв, открывающий новые пути в МРТ-диагностике. Данный препарат представлял из себя комплекс гадолиния с пентеновой кислотой диэтилентриаминпентауксусной (Gd-DTPA). Благодаря высокой гидрофильности Gd-DTPA не проникает через клеточные мембраны, в том числе через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), быстро выводится почками, практически
не вызывая побочных реакций [3]. Поэтому данный препарат относят к внеклеточным, так как здоровые клетки организма не позволяют препарату проникнуть внутрь, но при патологическом состоянии, например, когда нарушен ГЭБ, МРконтрастный агент проникает из кровеносного сосуда и, уменьшая время релаксации, визуализирует очаг поражения. МР-препарат Magnevist является внеклеточным, линейным и ионным. Ионные GBCA более стабильны, чем неионные GBCA, потому что ионные соединения обладают электростатическими силами положительных и отрицательных ионов. Неионные агенты менее стабильны и быстрее распадаются на свободный гадолиний и хелат [13].
Стабильность относится к тому, как жестко связанный ион гадолиния прикрепляется к хелатирующей молекуле и насколько вероятно диссоциация. Как правило, линейная структура препаратов имеет быструю скорость диссоциации [10]. То есть Magnevist имея линейную структуру быстро диссоциируется, а из-за своей ионной структуры имеет меньшую релаксируемость по сравнению с другими препаратами. Существуют по структуре два вида МР-контрастных препаратов, как говорилось выше, одни открытые, то есть линейные, другие закрытые – макроциклические. ProHance (1992) является одним из первых представителей макроциклических препаратов, а по физическим свойствам является неионным. Макроциклические препараты более устойчивые, так как ион гадолиния высвобождаются очень медленно и релаксивность, соответственно, меньше, но чтобы этот параметр не уступал Magnevist, препарат сделали неионным. ProHance является более безопасным, это позволило использовать препарат в большой дозе при тяжелых патологических процессах и в педиатрической практике. ProHance (гадотеридол) является единственным препаратом, одобренным для использования в тройной дозе (0,3 ммоль / кг) [13].

Несмотря на наличие побочных действий главной целью в следующей стадии разработок явилось улучшение качества изображения после введения МР-контрастных агентов, для чего следовало изменить структуру хелатного комплекса на линейную неионную. Как описывалось выше, неионные агенты менее стабильны по сравнению с ионными, поэтому степень токсичности препаратов становиться сильнее по причине ускоренного высвобождения свободных ионов гадолиния. Представителями данной группы являются Omniscan (1993), Optimark (1999). Неионные линейные GBCAsгадодиамиды (Omniscan) и гадоверетамид (OptiMARK) имеют самые низкие константы условной стабильности, и эта низкая стабильность, как полагают, связана с более высокой распространенностью случаев нефрогенного системного фиброза (НСФ) [18]. Релаксируемость данных препаратов также отличается, но не на большие значения. Омнискан имеет низкую стоимость. Следующими представителями линейных ионных контрастных средств стал MultiHance (2004) – внеклеточный препарат, имеющий большую релаксируемость по сравнению с Magnevist, несмотря на сходство по структуре. Основным вопросом также оставалась степень безопасности нового препарата. В сравнительных исследованиях показатель побочного эффекта составлял 8% (14/177) при введении MultiHance и 9% (16/183) после Magnevist [6].

Разница оказалась не велика, поэтому вредность обеих веществ равноценна.
Eovist/Primovist (2008) и Ablavar (2008) являются также линейными и ионными препаратами, только относятся к группе специфических, поэтому разделение будет уместным. Eovist используется для диагностики гепатобилиарной системы. Гепатобилиарные контрастные агенты обладают двойными свойствами GBCA, которые диффундируют во внеклеточном пространстве, а также активно переносятся в функционирующие гепатоциты и затем выводятся в желчь. Фармакокинетика гепатобилиарных GBCA предлагает расширенные возможности для оценки поражения печени и функциональной билиарной визуализации. Считается, что гадоксетическая кислота активно используется в гепатоцитах канальцевым
мультиспецифическим транспортером органического аниона (OATP 8). Последующая экскреция гадоксетиновой кислоты в желчь происходит через резистентный к множественной лекарственной устойчивости белок (MRP 3) [5]. В отличие от
стандартные внеклеточные контрастные вещества гадолиния, гадоксетическая кислота слабо связывается с белками плазмы. В результате, T1-релаксация больше, а усиление более интенсивное. По этой причине доза гадоксетиновой кислоты
(0,025 ммоль /кг массы тела) составляет одну четверть от обычных МРконтрастных агентов [11]. Ablavar является внутривенным контрастным агентом пула крови с хелато-альбуминовым комплексом, что делает его превосходным для сосудистой визуализации [13].

Большой молекулярный размер комплекса хелато-альбумина приводит к снижению скорости вращения молекул и значительно меньшему времени релаксации Т1 (19,0 л / ммоль / сек при 37°С, 1,5 Тл); примерно в пять раз больше, чем у внеклеточных агентов при 1,5 Тл. Это приводит к большей эффективности на единицу дозы гадолиния, поэтому для диагностических целей достаточно меньших объемов инъекций и меньшего количества инъекций [19]. Gadovist отличается от более раннего препарата ProHance (гадотеридол) небольшим изменением в структуре. Эти два агента отличаются только тем, что гидроксипропильная группа на молекуле гадотеридола заменяется тригидроксибутильной группой на гадобутроле молекулы [14], поэтому предпочтение какому-либо препарату отдавать не стоит, потому что структура, физико-химические особенности и тип препарата остаются теми же. Например, сравнение в исследовании данных МР-контрастных препаратов при опухоли головного мозга никаких различий не показала [14].

Dotarem является одним из современных препаратов, представленных на рынке. По структуре и физико-химическим свойствам он единственный из данной классификации имеет макроциклическую ионную природу. Наибольшая безопасность позволяет использовать препарат в педиатрической практике. Все линейные препараты начинают распадаться сразу после введения, а Dotarem, возможно, может циркулировать в крови более длительное время, так как термодинамическая стабильность препарата показала результаты, которые в 8 раз выше по сравнению с Gadovist [13]. Главным его преимуществом должна быть экономичность и возможность отслеживать течение заболевания и эффективность терапии после одной инъекции. Одним из альтернативных гадолинию МР-контрастных препаратов являются суперпарамагнитные оксиды железа и сверхмалые суперпарамагнитные оксиды железа, которые можно применять, чтобы избежать риск НСФ или при терминальной стадии почечной недостаточности, так как данные агенты несут наименьшую угрозу в отношении к данным органам. Для этого частицы железа покрывают различными полимерами. Полимеры могут ингибировать рост наночастиц
и приводить к малым размерам. Более того, полимеры также могут замедлять скорость роста ядер, что способствует образованию монодисперсных нанокристаллов (SPIO) [21]. У железных наночастиц очень большой магнитный момент, что приводит к неоднородности локального магнитного поля. Следовательно, интенсивность МРсигнала значительно снижается, темнеет на T2- и T2*-взвешенных изображениях. По размеру SPIO обычно классифицируют как пероральный (300 нм-3,5 мкм), полидисперсный (PSPIO, 50-150 нм) и ультрамалый (USPIO, около 20 нм) [12].

Кроме того, наночастицы USPIO с ядром оксида железа, которые являются монокристаллическими по своей природе, называются монокристаллическими наночастицами оксида железа (MION) [12], то есть конъюгаты используются со специфическими антителами, например, использование антимиозиновых антител в диагностике инфаркта миокарда [2], а MION с химически сшитой и аминированной полисахаридной оболочкой называются сшитыми наночастицами оксида железа (CLIO) [12]. Суперпарамагнитные частицы оксида железа используются в качестве контрастных средств для мононуклеарной фагоцитарной системы [17]. После внутривенной инъекции (приблизительно 80% вводимая доза) частиц SPIO поглощается печенью,
тогда как 5-10% будет в селезенке, остальная часть контрастного агента по убыванию в костном мозге (сверхмалые частицы), лимфатические узлы [19]. Разработанные препараты SPIO имеют необходимые заряд и размер для избирательного
поглощения клетками ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). После деградации SPIO в РЭС атомы железа включаются в состав гемоглобина эритроцитов [2]. Действие на время релаксации Т1 и Т2 также зависит от размеров наночастиц. Суперпарамагнитные частицы окиси железа относительно большего диаметра (≥50нм) главным образом укорачивают время Т2 (низкое r1/ r2). Суперпарамагнитные частицы окиси железа относительно малого диаметра (≤20нм) имеют высокое значение r1/r2 и могут использоваться как контрастные средства и сположительной, и с отрицательной контрастностью [4].

Большие частицы оксида железа используются для контраста кишечника [AMI-121 (то есть Lumirem и Gastromark), средний диаметр которых не менее 300 нм] и изображений печени / селезенки [AMI-25 (то есть Endorem и Feridex IV, диаметр 80-150 нм); SHU 555A (т.е. Резовист, средний диаметр 60 нм)]. Для получения изображений лимфатических узлов выбраны меньшие частицы оксида железа [AMI-227 (например, Sinerem и Combidex, диаметр 20-40 нм)], изображение костного мозга (AMI-227), перфузионное изображение [NC100150 (т.е. Clariscan, средний диаметр 20 нм) ] и МР-ангиографии (NC100150). Еще более мелкие монокристаллические наночастицы оксида железа исследуются для получения МРизображений с рецептором и магнитно-мечеными МР-томографами [20]. Использование USPIO в визуализации сосудов объясняется тем, что сверхмалые частицы скрыты от «надзора» клеток фагоцитоза, поэтому они легко циркулируют в кровотоке, но так как препарат захватывается макрофагами костного мозга, мы можем судить о состоянии данного органа [4]. Препарат на основе марганца является тканеспецифическим гепатотропным МР-контрастом. Химический аналог витамина В6, мангафодипир тринатрий (Mn-DPDP, Teslascan, Nycomed, Oslo, Norway) ион марганца хелатируется четырьмя молекулами меглумина. Молекула изотонична с кровью и имеет низкую вязкость. Его медленно вводят (2-3 мл / мин в течение 10- 20 мин) в концентрации 10 ммоль /
мл и в дозе 0,5 мл / кг. После введения иона Mn2+, содержащегося в молекуле, постепенно высвобождается в кровь из DPDP и замещается цинком, то есть происходит трансметаллизация [7]. Остаточный Mn накапливается в поджелудочной железе, слизистой оболочке желудка, надпочечниках и некоторых внутримозговых структурах [4]. Максимальное усиление ткани наблюдается в конце инфузии примерно через 20 мин и длится около 4 часов [7]. Mn-DPDP при клинической оценке показал значительное увеличение отношения сигнал/шум на Т1-изображениях. Он оказался эффективным при получении Т2- взвешенных МРТ-изображений (последовательность SE) и Т2- взвешенных (GR- последовательность) МРТ-изображений цирротических узлов и карциономы печени [1].

Заключение. Magnevist – это первое контрастирующее вещество, которое официально используется с 1988 года и является актуальным на сегодняшний день, и его можно назвать универсальным, учитывая критерии выбора, как цена, безопасность и
диагностическую ценность. MultiHance – это препарат линейной ионной структуры, как и Magnevist, имеющий наибольшую степень релаксации среди всех представителей внеклеточных МРконтрастирующих веществ. Применение данного препарата можно рекомендовать в онкологической практике для обнаружения более мелких метастатических очагов. Макроциклические препараты являются наиболее безопасными, так как константа диссоциации выше, поэтому целесообразно их использовать в педиатрической практике, так как риск более высок повлиять на развитие ребенка других групп МР-контрастных веществ. Например, Gadovist можно использовать для МРТ исследований плода. Также следует применять данные вещества при ограничениях по побочным эффектам, например, при заболеваниях почек. Преимущество линейных неионных МР-контрастных препаратов (Omniscan, Optimark) только в цене, они являются самыми дешевыми на рынке, но стоит учитывать то,
что по безопасности уступают всем остальным препаратам. Поэтому использование данных препаратов на детях строго запрещается, также нужно учитывать анамнез пациента. Применение суперпарамагнитых препаратов на основе железа, марганца и т д. временно приостановлено в клинике. Наночастицы оксида железа уже давно считаются малотоксичными и хорошо переносимыми в организме человека. Однако с расширением применения токсические эффекты, такие как окислительный стресс и воспалительная реакция и цитотоксичность все больше привлекли на себя внимание [9]. Такие побочные эффекты могут являться предшественниками онкологических заболеваний.

Литература
1. Сергеев П.В. Контрастные средства / Сергеев П.В., Поляев Б.А., Юдин А.Л., Шимановский Н.Л. // Руководство для врачей - М: издательство «Известия». - 2007г. – 496 с.
2. Шимановский Н.Л. Биохимическая фармакология / Шимановский Н.Л., Сергеев П.В. // Учебное пособие - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2010. -624 с.
3. Шимановский, Н.Л. 20 лет клинического применения магнитно - резонансных контрастных средств / Шимановский, Н.Л // Диагностическая интервенционная радиология. – 2009. - №3. – С. 5-13.
4. Эрнст Й. Руммени. Магнитно-резонансная томография / Эрнст Й. Руммени, Петер Раймер, Вальтер Хайндель [пер. с анг. под ред. Г.Г.Кармазановского] // Руководство для врачей - М: издательство «МЕДпресс-информ». - 2014г. – 848 с.
5. Alex Frydrychowicz. Hepatobiliary MR Imaging with Gadolinium Based Contrast Agents / Meghan G. Lubner, Jeffrey J. Brown, Elmar M. Merkle // J Magn Reson Imaging. – 2012 - 35(3). – Р. 492-511.
6. Frank G. Shellock. Safety of Gadobenate Dimeglumine (MultiHance) Summary of Findings From Clinical Studiesand Postmarketing Surveillance / Frank G. Shellock, John R. Parker, Carole Venetianer // Investigative Radiology - 2006 - Volume 41 - Issue 6 – Р. 500-509.
7. Giovanni Morana. Contrast agents for hepatic MRI / Giovanni Morana, Elisabetta Salviato, Alessandro Guarise // Cancer Imaging. – 2007. - 7 (Special issue A). - S24–S27.
8. Hale Ersoy. Biochemical Safety Profiles of Gadolinium-Based Extracellular Contrast Agents and Nephrogenic Systemic Fibrosis / Hale Ersoy, Frank J. Rybicki // J Magn Reson Imaging - 2007. - Volume 26, Issue 5. - P. 1190–1197.
9. Irai S. Oliveira. Blood pool contrast agents for venous magnetic resonance imaging / Irai S. Oliveira, Sandeep S. Hedgire, Weier Li, et al. // Cardiovasc Diagn Therapy. – 2016. - 6(6). – Р. 508–518.
10. Weinreb J. Understanding Gadolinium-Based Contrast Agents: From the Molecule Up / Weinreb J., Amirbekian S. // Medscape. - 2013г. – 4 p.
11. Janet Cochrane Miller. Gadoxetic Acid (Eovist) and Hepatobiliary MR Imaging / Janet Cochrane Miller, Raul N. // Radiology Rounds. – 2010. – Volume 8. – Issue 10. https://www.massgeneral.org/imaging/news/radrounds/ october_2010/ (дата обращения 10.01.2019).
12. Liang Shan. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) stabilized by alginate / Liang Shan // Molecular Imaging and Contrast Agent Database. – 2009. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23636/ (дата обращения 10.01.2019).
13. Lisa van Devender. The Pharmacist’s Role in Promoting the Safe. Use of Gadolinium-based Contrast Agents / Lisa van Devender, Benjamin I. Dickinson, Jeffrey Brown // 2016. – 14 p.
14. Maravilla K.R. Are There Differences between Macrocyclic Gadolinium Contrast Agents for Brain Tumor Imaging Results of a Multicenter Intraindividual Crossover Comparison of Gadobutrol with Gadoteridol (the TRUTH Study) / Maravilla K.R., Smith M.P., Vymazal J, et al // AJNR Am J Neuroradiol. - 2015 - 36(1). – Р. 14-23.
15. Marie-France Bellin. Extracellular gadolinium-based contrast media: An overview / Marie-France Bellin, Aart J. Van Der Molen. // European Journal of Radiology. – 2008. - 66. - Р. 168–174 .
16. Matthew J. Kuhn. Use of ProHance® (Gadoteridol): A Safe, Effective, and Versatile Contrast Agent for MR Imaging / Matthew J. Kuhn // Applied Radiology. – 2016. - Volume 45 Number 11. https://appliedradiology. com/articles/use-of-prohance-gadoteridol-a-safe-effective-and-versatilecontrast-agent-for-mr-imaging (дата обращения 10.01.2019).
17. Michael D. Hope. Vascular Imaging With Ferumoxytol as a Contrast Agent / Michael D. Hope, Thomas A. Hope, Chengcheng Zhu, et al. // Amarican journal of roentgenology. - 2015. – sep. - P. 366-373.
18. Michael F. Considerations in the Selection of a New Gadolinium-Based Contrast Agent / Michael F. Tweedle, Emanuel Kanal, Robert Muller // Applied Radiology. - May 2014. https://www.appliedradiology.com/articles/ considerations-in-the-selection-of-a-new-gadolinium-based-contrast-agent (дата обращения 10.01.2019).
19. Nevzat Karabulut. Contrast agents used in MR imaging of the liver / Nevzat Karabulut, Nevra Elmas // Diagn Interv Radiol. - 2006. - 12. – Р. 22-30.
20. Wang Y.X. Superparamagnetic iron oxide contrast agents: physicochemical characteristics and applications in MR imaging / Wang Y.X., Hussain S.M., Krestin G.P. // Eur Radiol. – 2001. -11 (11). – Р. 2319-2331.
21. Yi-Xiang J. Wang. Recent Advances in Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles for Cellular Imaging and Targeted Therapy Research / Yi-Xiang J. Wang, Shouhu Xuan, Marc Port, et al. // Curr Pharm Des. - 2013 - 19(37). – Р. 6575–6593.