Ю.П. Успенский, Н.В. Барышникова, О.Ю. Орлов, Л.Н. Белоусова, И.А. Лоева
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени И.П. Павлова
Городская больница Святой преподобномученицы Елизаветы, г. Сантк-Петербург
Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова
Барышникова Наталья Владимировна ― кандидат медицинских наук, доцент кафедры хирургической гепатологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени И.П. Павлова; начальник отдела научных и клинических исследований Городской больница Святой преподобномученицы Елизаветы.
195257, г. Санкт-Петербург, ул. Вавиловых, д. 14, тел. 8-921-301-33-77, e-mail: baryshnikova_nv@mail.ru
В статье представлена динамическая оценка информативности неинвазивного дыхательного аммонийного теста («Хелик-тест», ООО «Ассоциация медицины и аналитики», Санкт-Петербург) по сравнению с другими методами диагностики Helicobacterpylori. Верификация Helicobacterpylori проводилась с помощью быстрого уреазного теста, «Хелик-теста», гистологического метода, молекулярно-генетического исследования (полимеразная цепная реакция ― ПЦР). В результате показатели «Хелик-теста» были определены как промежуточные, сопоставимые с данными гистологического метода и ПЦР. Сравнение результатов «Хелик-теста» и гистологического метода показало тенденцию к повышению частоты их совпадения: в 2008-2009 гг. ― 70%, в 2012-2013 гг. ― 85%, что говорит о повышении эффективности дыхательного теста и совершенствовании методики его выполнения. В статье обсуждаются возможные ошибки методики, способные повлиять на результат теста: например, дыхание ртом, уменьшающее интенсивность сигнала, может привести к ложноотрицательному результату, а избыточный контакт раствора карбамида со слизистой ротовой полости может привести к ложноположительному результату вследствие активности уреазопродуцентов полости рта. При соблюдении правил проведения «Хелик-тест» может быть рекомендован как для первичной, так и для вторичной (после лечения) детекции микроорганизма.
Ключевые слова: дыхательный аммонийный тест, «Хелик-тест», Helicobacterpylori.
Y.P. Uspenskiy, N.V. Baryshnikova, O.Y. Orlov, L.N. Belousova, I.A. Loeva
St-Petersburg State medical university named after I.P. Pavlov
City hospital of St. venerablr martyr Elizabeth, St-Petersburg
North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov
Breath ammomium test in diagnostic of HELICOBACTER PYLORI infection:
advantages and shortcomings
In this article the dynamic assessment of efficacy of noninvasive breath ammonium test («Helic-test», Association of Medicine and Analytics, St.-Petersburg) in comparison with other methods of diagnostics of Helicobacter pylori infection is presented. Verification of Helicobacter pylori was made by rapid urease test, «Helic-test», a histologic method, molecular-genetic method (polimerase chain reaction ― PCR). Result of «Helic-test» was defined as intermediate, comparable with the results of histologic method and PCR. Comparison of results of «Helic-test» and histologic method showed a tendency to increase of frequency of their coincidence: in 2008-2009 – 70%, in 2012-2013 – 85% that speaks about increase of efficiency of breath ammonium test and improvement of a technique of its performance. In article possible errors of the technique of «Helic-test» are discussed: for example, the breath by a mouth can reduce a signal and can lead to false negative result; excess contact of a reagent (carbamide) with a oral cavity mucous can lead to false positive result due to activity of urease producing microbes (other than Helicobacter pylori) in oral cavity. At observance of rules of carrying out «Helic-test» it can be recommended both for primary, and for secondary (after treatment) diagnostic of Helicobacter pylori infection.
Key words: breath ammonium test, «Helic-test», Helicobacter pylori.
Использование неинвазивных методов диагностики инфекции Helicobacterpylori, в частности, дыхательных тестов, является крайне актуальным и требует постоянного проведения мониторинга информативности для улучшения качества обследования пациентов. Согласно IV Маастрихтскому консенсусу (2010), в качестве рекомендуемых методов диагностики Helicobacterpylori утверждены дыхательный тест с мочевиной, меченной С13 и иммуноферментный анализ Helicobacterpylori в кале (при использовании проверенного моноклонального теста) [1]. Однако в России повсеместное использование этих методов является пока сложной задачей. Возможностью проводить дыхательный тест с мочевиной, меченной С13, располагают далеко не все лечебные учреждения, даже в крупных городах России, поскольку для данного метода используются достаточно дорогие реактивы, требуется специальное оборудование и подготовка медперсонала. Иммуноферментный анализ кала используется также не везде, малоинформативен при замедлении эвакуации каловых масс в связи с разрушением антигенов микроорганизма.
В Санкт-Петербурге в 1997 году был разработан альтернативный метод диагностики H. pylori в выдыхаемом воздухе: «Хелик-тест» (ООО «Ассоциация медицины и аналитики») в двух вариантах ― индикаторные трубки и аппарат (компьютерная фиксация данных). В основе метода лежит детекция паров аммиака (второй метаболит гидролиза мочевины, образующийся в результате действия уреазы мощного уреазопродуцента H. pylori) в воздухе ротовой полости после приема обследуемым мочевины нормального изотопного состава (рис. 1) [2].
Рисунок 1.
Схема проведения «Хелик-теста»
При наличии инфекции определяется прирост уровня аммиака в выдыхаемом воздухе, что фиксируется по изменению цвета индикаторной трубки (прирост определяется в миллиметрах) (рис. 2) или по приросту показателя (относительные величины) при использовании Хелик-аппарата (рис. 3а, 3б).
Рисунок 2.
Картина, полученная при обследовании H. pylori-позитивного пациента с использованием Хелик-теста с индикаторными трубками (сверху ― базальный уровень ― 5 мм, снизу ― нагрузочный уровень ― 15 мм. Прирост ― 10 мм)
Рисунок 3а.
График, полученный при обследовании H. pylori-негативного пациента
По оси абсцисс ― минуты исследования (1-2 минуты ― базальный уровень, 3-9 минут ― нагрузочный уровень);
По оси ординат ― прирост, относительная величина
Рисунок 3б.
График, полученный при обследовании H. pylori-позитивного пациента
По оси абсцисс ― минуты исследования (1-2 минуты ― базальный уровень, 3-9 минут ― нагрузочный уровень);
По оси ординат ― прирост, относительная величина
К важным достоинствам данного метода относятся:
1. Простота и быстрота выполнения: по длительности анализ с использованием индикаторных трубок занимает 14 минут, с использованием аппарата ― 9 минут.
2. Обследование проводится «у постели больного», может проводиться силами среднего медицинского персонала.
3. Не требуется привлечения специальной лаборатории: результат теста виден сразу.
4. Не требуется транспортировки дыхательных проб.
5. Показатели не зависят от возраста, физической активности пациента и характера гастродуоденальной патологии.
6. Данный метод более дешевый по сравнению с радиоизотопным уреазным дыхательным тестом с мочевиной, меченой радиоактивным углеродом С13.
7. Тест-системы компактны и портативны.
Сравнительный анализ различных методов диагностики H. pylori
В течение пятилетнего периода нами оценивалась эффективность диагностики инфекции с использованием «Хелик-теста». В 2008-2009 гг. было проведено первое сравнительное исследование с целью оценки информативности методов диагностики инфекции H. pylori: быстрого уреазного теста, «Хелик-теста», гистологического исследования, молекулярно-генетического исследования ― метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и бактериологического исследования.
Было обследовано 134 пациента от 17 до 72 лет с патологией верхних отделов пищеварительного тракта: в исследование включались пациенты с жалобами на диспепсию, не принимающие в течение двух недель препараты, способные повлиять на микроорганизм и изменить результаты диагностических тестов (ингибиторы протонной помпы, антибиотики, препараты висмута). В первый день обследования всем пациентам проводилось эндоскопическое исследование – фиброэзофагогастродуоденоскопия (ФГДС) с забором четырех биоптатов (1 биоптат из тела желудка, 3 биоптата из антрального отдела желудка). Биоптат из тела желудка и один биоптат из антрума помещались в отдельные промаркированные пробирки (эппендорфы) с раствором формалина и отправлялись на гистологическое исследование. Быстрый уреазный тест проводился со вторым биоптатом из антрума. После данного анализа, что технически допустимо, этот биоптат помещался в промаркированную пробирку (эппендорф), содержащую физиологический раствор и отправлялся на молекулярно-генетическое исследование (ПЦР). Третий биоптат из антрума помещался в промаркированную пробирку, содержащую специальную транспортную среду и отправлялся для проведения бактериологического исследования. Во второй день обследования всем пациентам проводился «Хелик-тест» в двух вариантах (индикаторные трубки и Хелик-аппарат).
В результате было установлено, что максимальное количество положительных результатов определялось при использовании быстрого уреазного теста, минимальное количество – при посеве биоптатов. Промежуточные значения были определены для «Хелик-теста», гистологического метода (для антрального отдела желудка) и ПЦР, при этом обращало на себя внимание, что, с учетом статистической погрешности, между этими методами различия были недостоверны (рис. 4).
Рисунок 4.
Сравнительная характеристика результатов различных методов диагностики H. pylori
По оси абсцисс ― методы исследования;
По оси ординат ― количество положительных результатов, %
Вероятно, более редкое выявление микроорганизма с помощью гистологического метода в теле желудка по сравнению с антральным отделом может говорить о меньшей частоте встречаемости H. pylori в теле желудка, так как данный отдел не является типичным «местом обитания» микроорганизма. Отрицательный результат бактериологического метода при положительных результатах других методов исследования, по-видимому, связан со сложностью культивирования микроорганизма.Получение положительных результатов «Хелик-теста» при отрицательных данных гистологического метода или ПЦР может объясняться не ложноположительными результатами, а тем, что при проведении «Хелик-теста» определяются продукты, образующиеся вследствие уреазной активности (жизнедеятельности) H. pylori, а не сам микроорганизм, который может не попасть в биоптат, исследуемый с помощью гистологического метода или ПЦР.
В последующие годы проводилось совершенствование как методики, так и реактивов для проведения «Хелик-теста», что послужило причиной для второго сравнительного анализа методов диагностики H. pylori, который проводится с сентября 2012 года по настоящее время. К началу апреля 2013 обследовано 39 пациентов с жалобами на диспепсию. Всем пациентам проводилась фиброэзофагогастродуоденоскопия и комплекс диагностических методик для верификации инфекции. Были использованы 6 методов исследования: быстрый уреазный тест («Хелпил-тест»), дыхательный «Хелик-тест» (индикаторные трубки и аппарат), гистологическое исследование биоптатов (1 биоптат из тела желудка, 1 биоптат из антрального отдел желудка) ― проводилось врачом-патологоанатомом Антоновым П.В. (Санкт-Петербург), молекулярно-генетическое исследование ― ПЦР (1 биоптат из тела желудка, 1 биоптат из антрального отдела желудка) ― проводилось в НИЛ «Диагностика» (Санкт-Петербург), дыхательный тест с С13-мочевиной (анализ проб выдыхаемого воздуха проводился в Италии в лаборатории Quintron). Биоптаты для ПЦР-анализа предварительно замораживались при температуре -200С с последующей отправкой в лабораторию всех проб, набранных за месяц, одновременно. Образцы выдыхаемого воздуха транспортировались в Италию также один раз в месяц.
В результате установлено, что при использовании быстрого уреазного теста положительный результат был получен у 88% пациентов, при использовании «Хелик»-аппарата ― у 78% пациентов, «Хелик-теста» с индикаторными трубками ― у 78%. При гистологическом исследовании H. pylori определялся у 67% пациентов. Неожиданными оказались данные ПЦР-диагностики и дыхательного теста с С13-мочевиной: 17 и 22% положительных результатов соответственно.
На основании полученных данных можно говорить о необходимости проведения нескольких методов исследования для верификации H. pylori, так как полного совпадения результатов различных диагностических тестов не наблюдается. Низкий процент положительных результатов при использовании ПЦР и дыхательного теста с С13–мочевиной возможно связан с длительным процессом транспортировки. Следовательно, при выборе этих методов диагностики следует избегать долгого хранения образцов.
Анализ корреляционных взаимосвязей между результатами различных методов диагностики H. Pylori
При анализе корреляционных взаимосвязей между результатами различных методов было установлено, что существует прямая достоверная корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген ureC), быстрого уреазного теста и гистологического исследования (тело желудка), а также между результатами «Хелик-теста» и гистологического исследования (тело желудка) (рис. 5).
Рисунок 5.
Корреляционная связь между результатами «Хелик-теста» и гистологического метода исследования (p<0,05)
Таким образом, для повышения точности диагностики хеликобактериоза рекомендуется использовать как минимум два метода исследования, предпочтительно сочетание быстрого уреазного теста или «Хелик-теста» с гистологическим методом исследования (биоптат из тела желудка) или ПЦР (детекция гена ureC).
Сравнительный анализ результатов «Хелик-теста» и гистологического метода исследования
На протяжении пяти лет нашему пристальному вниманию подвергалась оценка результатов «Хелик-теста» по сравнению с результатами гистологического метода исследования. Выбор гистологического метода был продиктован тем, что используя именно этот метод, J.R. Warren и B.J. Marshall описали наличие спиралевидной бактерии в слизистой оболочке желудка больных активным хроническим гастритом [3]. Однако не следует забывать, что у гистологического метода есть также свои недостатки, в частности, возможность получения ложнонегативных результатов в связи с неправильным забором гастробиопсийного материала (биопсия только из антрального отдела желудка, скудные биоптаты, не содержащие эпителия и слизи), а также наличия участков кишечной метаплазии, погрешностей окраски, что не позволяет его рассматривать в качестве классического эталонного метода. В динамике отмечается тенденция к увеличению частоты совпадения результатов гистологического метода исследования и дыхательного «Хелик-теста» (рис. 6), что говорит о повышении эффективности дыхательного теста и совершенствовании методики его проведения.
Рисунок 6.
Оценка информативности «Хелик-теста» по сравнению с гистологическим методом
По оси абсцисс ― годы исследования;
По оси ординат ― частота совпадения и расхождения результатов, %
Ошибки при проведении «Хелик-теста» и их последствия
Важно заметить, что в ряде случаев неточные результаты «Хелик-теста» могут быть следствием несоблюдения методики проведения теста.
Например, нужно учитывать возможное наличие уреазопродуцентов в ротовой полости [4]. Нами было проведено исследование по выявлению уреазопродуцирующих бактерий в ротовой полости и желудке пациентов с хроническим гастритом для оптимизации техники диагностики инфекции Helicobacterpylori в выдыхаемом воздухе [5]. Для этого было обследовано 16 пациентов с диагнозом хронический гастродуоденит, подтвержденным эндоскопическим исследованием. Исследование проводилось в 4 этапа:
1. Измерение фоновой концентрации аммиака в выдыхаемом воздухе натощак (базальный уровень 1).
2. Измерение концентрации аммиака после того, как пациент прополоскал рот раствором 0,5 г мочевины (определение уреазопродуцентов в полости рта).
3. Измерение концентрации аммиака после того, как пациент прополоскал рот большим количеством воды (возврат к базальному уровню).
Измерение концентрации аммиака после того, как пациент принял порцию мочевины (500 мг) в 20 мл дистиллированной воды внутрь и прополоскал рот водой (определение уреазопродуцентов в желудке).
В результате было выявлено повышение уреазной активности микроорганизмов в полости рта у 9 пациентов из 16 (56%). У этих же пациентов был положителен классический дыхательный «Хелик-тест» для диагностики H. pylori в желудке. По результатам проведенного исследования нельзя исключить наличие H. pylori не только в желудке, но и в ротовой полости, так как данный микроорганизм обладает наиболее выраженной уреазной активностью. Вместе с тем нельзя исключить наличие других уреазопродуцентов в ротовой полости. Следовательно, необходимо с осторожностью проводить «Хелик-тест» во избежание получения ложноположительных результатов при контакте элементов тест-системы с органами полости рта. Рекомендуется обязательно полоскать рот перед каждым тестированием (определение как базального, так и нагрузочного уровня), а также предпочтительно принимать раствор карбамида через трубочку с целью минимизации контакта реагента со слизистой ротовой полости.
Несоблюдение пациентами простых правил (не курить, не употреблять пищу и т.п.) перед проведением методики может негативно сказаться на результатах. Кроме того, важно разъяснить пациенту необходимость дыхания через нос во избежание уменьшения силы сигнала, что наблюдается при дыхании через рот (рис. 7).
Рисунок 7.
Различия в эффективности метода при дыхании через нос и через рот (цит. по Быкову С.Э., 2012)
Из представленного рисунка видно, что дыхание через рот может привести к получению ложноотрицательного результата: уменьшение уровня измеряемого сигнала в данном случае связано с тем, что на вдохе и на выдохе ротовая полость вентилируется, уменьшая текущую концентрацию аммиака в отбираемой пробе.
Существует высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов при применении антибиотиков, препаратов висмута, ингибиторов протонной помпы в течение 2 недель до проведения теста.
В заключении следует отметить, что на основании длительного клинического опыта и научной оценки нам представляется, что при соблюдении правил проведения «Хелик-теста», этот метод неинвазивной диагностики Helicobacterpyloriявляется высокочувствительным и специфичным и может быть рекомендован как для первичной (до лечения), так и для вторичной (после лечения) детекции микроорганизма.
Литература
1. Malfertheiner P. Management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht IV/ Florence Consensus Report / P. Malfertheiner, F. Megraud, C. O’Morain et al. // Gut. – 2012. – Vol. 61. – P. 646-664.
2. КорниенкоЕ.А. Неинвазивныеметодыдиагностикиинфекции, вызванной Helicobacter pylori / Е.А. Корниенко, В.Е. Милейко, В.А. Самокиш, О.Н. Нажиганов // Педиатрия. – 1999. – №1. – С. 37-41.
3. Warren J.R. Unindentified curved bacilli on gastric epithelium in chronic gastritis / J.R. Warren, B.J. Marshall // Lancet. – 1983. – Vol. 1 (8336). – P. 1273-1275.
4. Morales-Espinosa R. Helicobacter pylori in the oral cavity is associated with gastroesophageal disease / R. Morales-Espinosa, A. Fernandez-Presas, G. Gonzalez-Valencia et al. // Oral Microbiol Immunol. – 2009. – Vol. 24. – P. 464-468.
5. Барышникова Н.В. Тактика гастроэнтеролога при использовании методов неинвазивной диагностики Helicobacter pylori / Н.В. Барышникова, А.С. Смирнова // Клинико-лабораторный консилиум. – 2012. – № 3 (43). – С. 81-86.
