УДК 61

1МИРЗАЕВА С.Ш., 1ГАРАФЕЕВА Р.Р., 1ГЕРИХАНОВА М.М.

1Казанский государственный медицинский университет, 420012, ПФО, г.Казань, Ул. Бутлерова, 49.

Зависимость уровня лактоферрина от показателей фосфорно-кальциевого обмена при хронической болезни почек

Резюме. Актуальность проблемы. Лактоферрин относится к группе природных иммуногенных белков молока и является представителем железосвязывающих гликопротеинов семейства трансферринов. В настоящее время лактоферрин рассматривается как
возможный диагностический показатель при различных патологических состояниях. Изучение концентраций лактоферрина может также использоваться для диагностики и мониторинга заболеваний почек.

Ключевые слова: фосфорно-кальциевый обмен, лактоферрин, хроническая болезнь почек.

Контактное лицо:

Мирзаева Сара Шамилевна
Студент 6 курса, лечебного факультета, Казанский государственный медицинский университет,
420012, ПФО, г.Казань, Ул. Бутлерова, 49. Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. , телефон: +7(917) 283-86-84

1MIRZAEVA S.SH., 1GARAFEEV R.R., 1GERIKHANOVA M.M

1Kazan State Medical University. 420012, ПФО, Russia, Kazan, Butlerov str. 49.

The dependence of the level of lactoferrin from indicators of calcium-phosphorus metabolism in chronic kidney disease

Abstract. Background. Lactoferrin belongs to the group of natural immunogenic milk proteins and is a representative of iron-binding glycoproteins of the transferrin family. Currently, lactoferrin is considered as a possible diagnostic indicator for various pathological conditions. The study of lactoferrin concentrations can also be used to diagnose and monitor kidney disease.

Key words: calcium-phosphorus metabolism, lactoferrin, chronic kidney disease.

Contact person:

Mirzaeva S. Sh.
Kazan State Medical University. 420012, ПФО, Russia, Kazan, Butlerov str. 49.
Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. , телефон: +7(917) 283-86-84

В нашем исследовании мы попытались выявить зависимость уровня лактоферрина от показателей фосфорно-кальциевого обмена при хронической болезни почек. Лактоферрин относится к группе природных иммуногенных белков молока и является представителем железосвязывающих гликопротеинов семейства трансферринов. В настоящее время лактоферрин рассматривается как возможный диагностический показатель при различных патологических состояниях [3,2]. Изучение концентраций
лактоферрина может также использоваться для диагностики и мониторинга заболеваний почек [3]. Ранее было выявлено, что лактоферрин присутствует в почках: был найден мРНК лактоферрина, который экспрессируется в дистальных канальцах коркового вещества, кроме того, лактоферрин продуцируется и выделяется в восходящей части канальца и далее реабсорбируется по ходу канальцев, в основном после насыщения железом [5]. Одной из приоритетных задач перед мировым сообществом ученых и врачей является поиск и изучение биомаркеров, отражающих нарушение функции почек. В то же время, современная персонифицированная медицина диктует необходимость определения и ассоциирования с патологическими состояниями всё большего числа молекул-предвестников болезней. На сегодняшний день имеется мало исследований, которые отражают взаимосвязь показателей активности заболеваний почек с концентрацией лактоферрина. Наличие большого количества белка ЛФ в канальцах, но очень низкие его уровни в моче указывают на дополнительные функции ЛФ в почках. Стоит обратить внимание на то, что ЛФ участвует в метаболизме железа, поглощая свободное железо из мочи, тем самым делая его доступным для метаболизма.

Также возможно, что в качестве хелатора железа и антиоксиданта ЛФ участвует в антиоксидантных защитных системах, которые защищают почку от немикробного окислительного повреждения, то есть, при ишемии-реперфузии и воспалении.
Таким образом, оценка соотношений клинической картины и экспрессии гена ЛФ может иметь большую клиническую значимость, явится основополагающей для выработки методов первичной и вторичной профилактики, диагностики, выбора тактики лечения хронической болезни почек, определения индивидуальных факторов риска и прогноза.
Также до сих пор практически не существует исследований зависимости уровня лактоферрина от показателей фосфорно-кальциевого обмена. В одной из работ Григорьевой Д.В. и соавт. [1] проводилось исследование регуляции внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция в нейтрофилах при действии рекомбинантного лактоферрина. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о способности рекомбинантного лактоферрина инициировать увеличение концентрации кальция в цитозоле нейтрофилов с последующей активацией Ca2+-зависимых функциональных ответов нейтрофилов. Кроме того показано, что лечение блокаторами кальциевых каналов снижает выделение лактоферрина [8]. Гемодиализ с использованием цитрата в качестве антикоагулянта удаляет экстракорпорально кальций, блокируя высвобождение лактоферрина [6] из полиморфноядерных лейкоцитов.
Отметим, что ряд авторов не отметили корреляции между уровнем лактоферрина и почечной недостаточностью. Например, Deicher R. et al. [7] замеряли содержание бета (2) -микроглобулина (бета(2)м) и лактоферрина полиморфноядерных лейкоцитов при почечной недостаточности и после трансплантации почек. Полиморфноядерные лейкоциты лизировали ультразвуком и после центрифугирования оба белка анализировали в супернатанте методом иммуноферментного анализа. Несмотря на заметные различия в уровнях бета(2)м в плазме, среди анализируемых групп не было обнаружено существенной разницы в содержании бета (2) m и лактоферрина полиморфноядерных лейкоцитов. Не было также никакой корреляции между уровнем бета(2)м в плазме и содержанием бета(2)м полиморфноядерных лейкоцитов. У контрольных субъектов, а также у реципиентов почечного аллотрансплантата с хорошо функционирующим трансплантатом уровень бета(2)м полиморфноядерных лейкоцитов положительно коррелировал с уровнем лактоферрина полиморфноядерных лейкоцитов (r = 0,55, p<0,001; n = 55). Оба белка считаются колокализуемыми в пероксидазо-отрицательных гранулах полиморфноядерных лейкоцитов. Однако в азотемических и уремических группах пациентов не было обнаружено корреляции.

Результаты иммунофлюоресценнтного анализа полиморфноядерных лейкоцитов контрольной группы показало цитоплазматическое гранулированное распределение гранул обоих белков. В полиморфноядерных лейкоцитых уремических пациентов лактоферрин перешел в перинуклеарную локализацию. Полиморфноядерные лейкоциты, полученные у уремических пациентов, не вызывали увеличения выделения лактоферрина после стимуляции хемотаксическим пептидом f-Met-Leu-Phe по сравнению с полиморфноядерными лейкоцитами, полученными от здоровых добровольцев. Авторы отметили, что у уремических пациентов отмечается аномалии содержания лактоферрина полиморфноядерных лейкоцитов и его высвобождение, которые являются обратимыми после успешной трансплантации почек. Обратим внимание на то, что механизмы, связанные с дегрануляцией полиморфноядерных лейкоцитов, до конца не ясны. Однако выявлено, что важную роль при этом играют внутриклеточные ионы кальция [9].

Материалы и методы Диагностический поиск был направлен на выявление частоты нарушений фосфорно-кальциевого обмена и их связи с уровнем лактоферрина в крови. Критерии включения: мужчины и женщины старше 18 лет; наличие хронической болезни почек, с и без признаков хронической почечной недостаточности С1-С5 согласно критериям KDIGO от 2012 года. Абсолютные критерии исключения: структурные аномалии почек, поликистозная болезнь; эндокринопатии (кроме сахарного диабета, ожирения); инфекция вирусами гепатитов, ВИЧ; системные инфекции, септические состояния; беременность. Клинически определяли следующие показатели фосфорно-кальциевого обмена: фосфор, кальций, кальций ионизированный (колориметрический метод, ионселективные электроды), паратгормон (электрохемилюминесцентный иммуноанализ). Определение концентрации лактоферрина в образцах крови проводили иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора Hbt human Lactoferrin ELISA TEST KIT (HyCult Biotechnology (Нидерланды)), согласно инструкции. Расчет результатов проводят путем вычисления средние значения абсорбции (A450) для дублей каждого
из стандартов, образцов и контролей. Построение калибровочной кривой проводили с использованием метода аппроксимации.

Исследование экспрессии гена ЛФ методом ПЦР проводилось по следующей схеме: суммарную РНК выделяли из цельной крови. РНК выделяли в соответствии с протоколом miRNEasy. Далее РНК использовалась в реакции обратной трансрипции с использованием обратной транскриптазы Supersript IV (Thermofisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. ПЦР проводили с использованием матермикса iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad).

Результаты В исследовании участвовало 50 человек, из которых 10 здоровых добровольцев, вошедших в контрольную группу. Возраст 40 пациентов составил от 20 до 75 лет (45,43+2,32). Из них 23 женщины и 17 мужчин. Все пациенты, участвовавшие в исследовании, разделены на следующие группы: I группа – пациенты с хронической болезнью почек иммунной природы (n=20); II группа – пациенты с хронической болезнью почек не иммунной природы (n=20); контрольная группа (n=10). В первую группу вошли пациенты со следующими диагнозами: хронический гломерулонефрит, болезнь Шегрена, гипергомоцистеинемия быстропрогрессирующий гломерулонефрит микроскопический полиангиит, гломерулонефрит с полулуниями, некротизирующий капиллярит. Во вторую группу вошли пациенты со следующими диагнозами: диабетическая нефропатия, поликистозная болезнь почек, ишемическая болезнь почек, уратная нефропатия, хроническая почечная недостаточность в исходе гипертонического нефроангиосклероза, гипертонический ангиосклероз, фибромускулярная дисплазия почечных артерий, ишемическая нефропатия, хронический пиелонефрит. Из 40 пациентов 37 страдали артериальной гипертензией. Микроскопический полиангиит выявлен у 14 пациентов, хронический гломерулонефрит у 7, поликистозная болезнь почек у 2 пациентов, тромботическая микроангиопатия у 2 пациентов, у 15 пациентов Ишемическая нефропатия, первичный антифосфолипидный синдром, терминальная стадия почечной недостаточности в исходе хронического гломерулонефрита, ХБП в исходе гипертонического нефроангиосклероза, хроническая почечная недостаточность в исходе гипертонического нефроангиосклероза, хроническая почечная недостаточность смешанного генеза, хронический пиелонефрит, хронический тубулоинтерстипиальный нефрит с нарушением функции почек.
По классификации ХБП (KDIGO, 2012) пациенты были распределены следующим образом:
1. Пациенты с хронической болезнью почек иммунной природы: – C1-C2 – 7 пациентов; – С3а-С5 – 13 пациентов;
2. Пациенты с хронической болезнью почек не иммунной природы: – С3а-С5 – 20 пациентов.
При изучении частоты встречаемости нарушений фосфорно-кальциевого обмена было выявлено, что снижение уровня кальция ниже допустимых величин имеют 15% пациентов, гиперкальциемия имеется у 4% пациентов. Средние значения показателей фосфорно-кальциевого обмена представлены в таблице 1.

По результатам обследования повышение уровня ионизированного Са имеют 12% обследованных, 42% обследованных имеют гиперфосфатемию, у 59% пациентов повышен уровень паратгормона. 5% пациентов имеют пониженный уровень паратгормона. Среднее значение лактоферрина в исследуемой выборке составило 49,428+3,425. Также было проведено исследования зависимости уровня лактоферрина от высоты активности воспаления (рассчитывалось по уровню СРБ). Корреляции обнаружено не было. Однако, при этом выявлено, что у пациентов с суточной протеинурией более 150 мг сутки отмечается рост уровня лактоферрина (53,2+4,25 по сравнению с 43,7+8,45 нг/мл). Корреляции между стадией ХБП и уровнем лактоферрина получено не было. При сопоставлении уровня лактоферрина у пациентов с ХБП неимунной и иммунной природой на ранних и поздних стадиях статистически достоверных данных получено не было (p>0,05).
В результате исследований выявили статистически достоверную разницу (p<0,05) при сравнении уровня ЛФ (39,96+5,04), фосфора (1,23+0,06) у группы пациентов с хронической болезнью почек иммунной природы с группой пациентов с хронической болезнью почек не иммунной природы (ЛФ (65,0+2,97), фосфор (1,55+0,08)). Уровень ЛФ у пациентов с хронической болезнью почек иммунной природы достоверно ниже. При изучении частоты встречаемости нарушений фосфорно-кальциевого обмена было выявлено, что снижение уровня кальция ниже допустимых величин имеют 15% пациентов, гиперкальциемия имеется у 4% пациентов.При проведении корреляционного анализа показателей фосфорно-кальциевого обмена с уровнем лактоферрина выявлено, что в исследуемой выборке имеется высокая корреляция (0,828, p<0,01) только между уровнями лактоферрина, фосфора и паратгормоном. По остальным показателям фосфорно-кальциевого обмена и ЛФ статистически достоверная корреляция не выявлена.

Заключение В данном исследовании предпринята попытка максимальной широко рассмотреть особенности взаимосвязи и прогностического значения лактоферрина и регуляции его гена с клиническими и лабораторными проявлениями хронической болезни почек, впервые в мире, так как на сегодняшний день практически не существует исследований зависимости уровня лактоферрина от показателей фосфорнокальциевого обмена. В ходе исследования нами было проведено сопоставление концентрации лактоферрина в крови и показателей фосфорно-кальциевого обмена у 40 больных с хронической болезнью почек и 10 здоровых добровольцах. Выявлено, что уровень ЛФ и фосфора у пациентов с хронической болезнью почек иммунной природы достоверно ниже, чем у пациентов с хронической болезнью почек не иммунной природы. При этом данные ПЦР демонстрируют, что дажев образцах с наименьшим уровнем ЛФ, последовательность гена присутствует в геноме. Следовательно,
снижение уровня ЛФ в крови может быть связано с заболеванием. Корреляции между стадией ХБП и уровнем лактоферрина получено не было. Уровень лактоферрина и фосфора у пациентов с хронической болезнью почек иммунной природы достоверно ниже, чем у пациентов с хронической болезнью почек не иммунной природы. В дальнейшем необходимо проведение исследования с целью выявления и оценки прогностического значения лактоферрина при хронической болезни почек на более крупной выборке.

Литература
1. Григорьева Д. В. Са2+-сигнализация в нейтрофилах при действии рекомбинантного лактоферрина человека/ Григорьева Д. В. – 2016. − С.239- 242
2. Зурнаджьянц В. А. Ферропротеины в диагностике воспалительного процесса в ране при грыжах передней брюшной стенки/ Зурнаджьянц В. А., Бондарев В. А., Кчибеков Э. А., Зурнаджьянц А. В. // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. − 2014. − №4 (175). − С.32-34
3. Михайлова Е.И. Фекальный лактоферрин в выявлении колоректального рака на разных стадиях его развития/ Михайлова Е.И., Филипенко Н.В. // Проблемы здоровья и экологии. − 2012. − №4 (34). − С.98-102
4. Немцова Е. Р. Иммуноферментный метод определения лактоферрина человека и его использование для диагностики гнойно-септических осложнений / Немцова Е. Р. //Вопросы медицинской химии. – 1995. – Т. 41. – №. 3. – С. 58-61
5. Аbrink M. Expression of lactoferrin in the kidney: implications for innate immunity and iron metabolism / Аbrink M. //Kidney international. – 2000. – Т. 57. – №. 5. – P. 2004-2010.
6. Böhler J. Reduction of granulocyte activation during hemodialysis with regional citrate anticoagulation: dissociation of complement activation and neutropenia from neutrophil degranulation/ Böhler J., Schollmeyer P., Dressel B., Dobos G. et al.// J Am Soc Nephrol. − 1996. – v.7. – P.234– 241.
7. Deicher R. Neutrophil β2-microglobulin and lactoferrin content in renal failure patients/ Deicher R. et al. //American Journal of Kidney Diseases. – 2000. – v. 35(6). – P. 1117-1126.
8. Haag-Weber M. Granulocyte activation during haemodialysis in the absence of complement activation: Inhibition by calcium channel blockers/ Haag-Weber M., Schollmeyer P., Hörl W.H. //Eur J Clin Invest. – 1988. – v.18. – P.380–385.
9. Schmaldienst S. Angiogenin: a novel inhibitor of neutrophil lactoferrin release during extracorporeal circulation / Schmaldienst S. et al.//Kidney and Blood Pressure Research. – 2003. – v. 26(2). – P. 107-112.